王 浦 陳 燁

南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院消化內科(510515)

背景：艱難梭菌感染(CDI)是最常見的機會致病菌感染，抗菌藥物是一線治療用藥，但存在治療效果不佳、感染復發(fā)、再燃等情況，有必要開發(fā)新型的抗感染藥物。目的：探討SR1001對CDI的干預作用及其潛在機制，探尋潛在的干預靶標。方法：培養(yǎng)艱難梭菌(C.difficile)，將結腸癌HT-29細胞分為對照組、CDI組(感染C.difficile)和SR1001治療組(感染C.difficile+SR1001干預治療)，觀察HT-29細胞形態(tài)改變情況，CCK-8法檢測細胞增殖情況，蛋白質印跡法檢測PI3K/AKT/mTOR信號通路表達情況，ELISA法檢測細胞上清液中TcdB含量。結果：與對照組相比，CDI組細胞透亮變圓，凋亡明顯；細胞增殖受抑制情況隨時間延長而加重，且細胞增殖能力明顯低于對照組(P<0.05)，PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化蛋白表達明顯升高，上清液中TcdB含量明顯增高(P<0.05)。給予SR1001治療后，細胞趨于正常“鋪路石”樣排列，凋亡改善，細胞增殖能力明顯高于CDI組，PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化蛋白表達明顯降低，上清液中TcdB含量明顯減少。結論：SR1001可通過干擾PI3K/AKT/mTOR信號通路磷酸化，逆轉C.difficile對結腸癌細胞的生長抑制作用。

艱難梭菌(C.difficile)是一種革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)是目前最常見的醫(yī)院獲得性感染之一[1]。C.difficile定植于腸道，當宿主腸道菌群失衡時，C.difficile大量生長，釋放毒素TcdB，造成細胞骨架破壞，凋亡壞死，破壞上皮屏障，引起CDI的發(fā)生。輕癥感染僅引起腹瀉，重癥感染可發(fā)展為偽膜性腸炎，甚至中毒性巨結腸、腸穿孔等并發(fā)癥。

輔助性T細胞17(Th17細胞)參與多種感染性疾病和炎性疾病[2-3]。有研究表明，Th17細胞通過分泌IL-17誘發(fā)炎癥反應，促進CDI的發(fā)生[4-5]。Yu等[6]通過檢測CDI中的IFNs，發(fā)現(xiàn)重癥CDI患者Th1細胞轉變?yōu)門h17細胞。維甲酸相關孤核受體(RORs)參與Th17炎性細胞IL-17分泌等功能的調控[7]。SR1001可非特異性拮抗RORα與RORγt活性，抑制IL-17的產生，從而改善疾病的癥狀，減緩疾病的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過建立C.difficile細胞感染模型并給予SR1001藥物干預，旨在探討SR1001對CDI的治療作用及其機制。

材料與方法

一、細胞和主要試劑

人結腸癌HT-29細胞由南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院消化科保種培養(yǎng)傳代，C.difficile菌株購自ATCC公司，DMEM培養(yǎng)基和胰酶購自Hyclone公司，胎牛血清購自Gibco公司，CCFA和BHI購自北京索萊寶科技有限公司，SR1001購自MedChemExpress公司，PI3K、AKT、mTOR、p-AKT、p-mTOR購于Abcam，p-PI3K購于北京博奧森生物技術有限公司，CCK-8檢測試劑盒購于碧云天生物技術有限公司，人艱難梭菌毒素B(TcdB)ELISA試劑盒購于江蘇酶標生物科技有限公司。

二、研究方法

1.C.difficile培養(yǎng)：將C.difficile菌株接種于CCFA培養(yǎng)皿中。37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后，接種于BHI液體培養(yǎng)24 h，采用紫外分光光度計測量波長600 nm處的吸光度值(A值)，將菌懸液濃度調整至1×108CFU/mL，2 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液，用于后續(xù)細胞實驗。

2.細胞培養(yǎng)和分組：結腸癌HT-29細胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)。使用0.25%胰蛋白酶消化細胞，制備細胞懸液并接種于96孔板，待細胞生長融合至80%時，將細胞分為對照組、CDI組和SR1001治療組，對照組不作任何處理，CDI組細胞加入1×108CFU/mLC.difficile培養(yǎng)上清液，SR1001治療組加入1×108CFU/mLC.difficile培養(yǎng)上清液+5 μmol/L SR1001，孵育48 h。

3.CCK-8法檢測細胞增殖：取各組對數(shù)生長期細胞，接種于96孔板上，每孔約2 000個細胞。分別于培養(yǎng)0、12、24、48 h時加入10 μL CCK-8溶液孵育2 h，上酶標儀檢測450 nm波長處的A值，繪制生長曲線。

4.蛋白質印跡法：將各組HT-29細胞鋪于6孔板中，RIPA裂解法提取蛋白，BCA蛋白定量后，經電泳、轉膜、封閉、孵育抗體(PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR工作濃度均為1∶1 000；GAPDH工作濃度為1∶20 000)，ECL發(fā)光顯色，檢測PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化蛋白表達情況。

5.ELISA法：根據(jù)試劑盒說明書，取各組孵育48 h后的細胞培養(yǎng)上清液，檢測TcdB含量。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、SR1001減輕C.difficile對HT-29細胞的毒性作用

與對照組(圖1A)相比，CDI組細胞變圓透亮，凋亡明顯，失去正常細胞生長形態(tài)(圖1B)。SR1001治療組細胞部分恢復生長形態(tài)，呈“鋪路石”樣排列(圖1C)。

A：對照組；B：CDI組；C：SR1001治療組

二、SR1001可拮抗C.difficile的抑制作用

CCK-8法結果顯示，CDI組細胞增殖受到明顯抑制，并隨時間延長而加重(P=0.00)，48 h時細胞增殖能力明顯低于對照組(P<0.05)，而給予SR1001治療后，細胞增殖能力有所改善(P<0.05；圖2、表1)。證實SR1001可通過改善細胞增殖能力來發(fā)揮抑制C.difficile毒性的作用。

圖2 CCK-8實驗測定不同時間點HT-29細胞的增殖能力

三、SR1001可降低C.difficile感染HT-29細胞后PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化蛋白表達

蛋白質印跡法結果顯示，C.difficile感染可使p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達較對照組明顯升高，經SR1001治療后，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達明顯降低(圖3、表1)，而三組PI3K、AKT、mTOR總蛋白含量無明顯差異。提示SR1001可通過調控PI3K/AKT/mTOR通路改善C.difficile感染情況。

1 Da=0.992 1 u

表1 SR1001對細胞增殖、PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化蛋白表達以及C.difficile定植的作用

四、SR1001可抑制C.difficile定植

ELISA法結果顯示，與對照組相比，CDI組細胞上清液中TcdB含量明顯升高，給予SR1001治療后，上清液中TcdB含量明顯降低(圖4、表1)。說明SR1001可抑制C.difficile在細胞中的定植。

圖4 ELISA法測定HT-29細胞培養(yǎng)上清液中TcdB含量

討 論

近年來，CDI居高不下的感染率越來越引起關注[8]。C.difficile毒素TcdB作用于腸上皮細胞，破壞細胞骨架，誘導細胞壞死凋亡，破壞上皮完整性[9]，從而誘導多種病變。多種因素參與CDI的發(fā)生、進展，炎癥反應是CDI發(fā)生過程中的重要因素，Th17細胞是促炎細胞的亞群之一，可促進炎癥反應，分泌多種促炎因子[10]。IL-17是Th17細胞分泌的重要的炎癥因子，IL-17失衡可引起過度反應，從而導致腸道組織破壞，RORs作為特異性轉錄因子可調控IL-17分泌。目前，多種研究表明，RORs特異性逆激動劑可有效控制與Th17細胞相關的自身免疫病[7,11-14]。SR1001是一種高選擇性和特異性RORs逆激動劑，可抑制Th17細胞分化和功能[7]。本研究中，以SR1001干預C.difficile感染細胞，可明顯改善細胞毒性作用，逆轉C.difficile對細胞增殖的抑制作用，并可抑制C.difficile定植。

Th17細胞產生IL-17作為Th亞群參與上皮細胞和中性粒細胞介導的多重免疫反應，抵抗外來微生物，并參與各種自身免疫病的發(fā)展。Th17細胞的分化受細胞內一系列信號級聯(lián)和復雜的轉錄因子網(wǎng)絡的控制。最近研究表明，PI3K/AKT/mTOR通路參與細胞代謝、增殖、分化等諸多過程，該通路通過調節(jié)STAT3磷酸化、調控HIF-1α表達以及激活RORγt核移位、下調Gfi1等多種機制正向調節(jié)Th17細胞的分化，是Th17細胞形成的重要經典途徑[15]。本研究結果發(fā)現(xiàn)C.difficile感染細胞后，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達較對照組明顯升高，而SR1001干預治療后，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達較CDI組均有所下降，說明SR1001可通過干預PI3K/AKT/mTOR通路抑制C.difficile感染。

綜上所述，本研究通過建立C.difficile感染的體外模型，并給予SR1001干預治療，揭示SR1001可通過下調p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達來抑制PI3K/AKT/mTOR通路，從而緩解C.difficile毒素作用，促進細胞增殖，同時可抑制C.difficile定植，為進一步研究CDI的免疫機制，探尋CDI干預靶標，以及CDI的防治提供了一定的參考和依據(jù)。