莊肇朦 謝 敏 張益光 呂 賓

溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化內(nèi)科1(325000) 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科2

背景：腸易激綜合征(IBS)的發(fā)病原因和機(jī)制尚未完全明確，臨床上缺乏有效的預(yù)防和診治手段。近年越來越多的研究認(rèn)為腸道局部黏膜免疫功能異常在IBS發(fā)病中起有重要作用。目的：探討腸道樹突細(xì)胞(DC)在腹瀉型IBS(IBS-D)大鼠結(jié)腸黏膜Th1/Th2免疫應(yīng)答途徑失衡中的作用及其對內(nèi)臟高敏感的影響。方法：將45只成年SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、NS對照組和模型組，每組各15只。以乙酸灌腸聯(lián)合束縛應(yīng)激制備大鼠內(nèi)臟高敏感模型，以腹壁回撤反射(AWR)實(shí)驗(yàn)和大鼠糞便性狀評估內(nèi)臟敏感性。采用流式細(xì)胞分選技術(shù)分離經(jīng)相應(yīng)特異性抗體標(biāo)記的腸系膜淋巴結(jié)DC以及脾臟初始CD4+T細(xì)胞并體外進(jìn)行共培養(yǎng)，以MTT法檢測CD4+T細(xì)胞的增殖能力，ELISA法檢測Th1途徑細(xì)胞因子IL-12、IFN-γ和Th2途徑細(xì)胞因子IL-4、IL-9的分泌能力。結(jié)果：與NS對照組和空白對照組相比，模型組大鼠內(nèi)臟敏感性明顯增高(P<0.05)，腸道淋巴結(jié)來源的DC促進(jìn)脾臟CD4+T細(xì)胞增殖的能力增強(qiáng)(P<0.05)，IL-4和IL-9分泌量明顯升高(P<0.05)，IL-12分泌量明顯減少(P<0.05)。結(jié)論：IBS-D內(nèi)臟高敏感大鼠腸道DC的抗原呈遞能力增強(qiáng)，誘導(dǎo)Th2途徑免疫應(yīng)答能力亢進(jìn)，進(jìn)而導(dǎo)致局部腸道黏膜Th1/Th2免疫應(yīng)答途徑失衡。

腸易激綜合征(IBS)的發(fā)病原因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，近年越來越多的研究認(rèn)為腸道和全身免疫應(yīng)答的失調(diào)以及免疫調(diào)節(jié)功能異常與IBS發(fā)病密切相關(guān)，其中腸道局部黏膜免疫功能異常在IBS發(fā)病中起有重要作用。

抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cells, APC)在腸黏膜免疫功能方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。樹突細(xì)胞(dendritic cell, DC)屬APC，具有強(qiáng)大的誘導(dǎo)T細(xì)胞初次免疫應(yīng)答的能力，是誘導(dǎo)初始T細(xì)胞(Th0細(xì)胞)活化的主要APC[2]。有研究[3-4]發(fā)現(xiàn)腹瀉型IBS(IBS-D)大鼠和患者結(jié)腸黏膜組織中DC數(shù)量增多，CD4+Th2免疫應(yīng)答途徑相關(guān)細(xì)胞因子分泌增多，肥大細(xì)胞過度活化脫顆粒，且與后期的內(nèi)臟高敏感癥狀持續(xù)時(shí)間、腸道繼發(fā)性感染風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。本研究通過觀察IBS-D大鼠腸黏膜CD4+T細(xì)胞Th1/Th2途徑免疫應(yīng)答失衡的現(xiàn)象，旨在探討DC對IBS-D大鼠內(nèi)臟高敏感和Th1/Th2免疫平衡的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物

45只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由第三軍醫(yī)大動物醫(yī)學(xué)中心提供，無畸形，無外傷，皮膚無感染，體質(zhì)量(250±10)g，常規(guī)飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。環(huán)境設(shè)置：室溫22～24 ℃，濕度<60%，噪音<50 db。

二、主要儀器與試劑

IgG isotype matehed antibodies、CD4熒光抗體(美國eBioscience公司)，MHCⅡ、CD11b、CD80、CD86熒光抗體(美國BD公司)；流式細(xì)胞檢測儀(FACSVantage SE)，每100個(gè)細(xì)胞中加入80 μL緩沖液和20 μL 抗CD4熒光抗體，每110個(gè)細(xì)胞中加入80 μL緩沖液和25 μL 抗CD11b熒光抗體，調(diào)節(jié)流式細(xì)胞儀使目標(biāo)細(xì)胞通過樣品室的濃度為100～300個(gè)/s；8F導(dǎo)尿管(直徑2 mm，球囊最大容量3 mL，最大直徑2 cm)，用于結(jié)直腸內(nèi)球囊擴(kuò)張導(dǎo)管(浙江康康醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))；冰乙酸、MTT(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；IL-12、IL-4 ELISA試劑盒(美國eBioscience公司)；IFN-γ、IL-9 ELISA試劑盒(Cusabio公司)。

三、研究方法

1.實(shí)驗(yàn)分組和模型建立：采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為空白對照組、0.9% NaCl溶液對照組(NS對照組)和模型組，每組各15只。模型組采用乙酸灌腸聯(lián)合束縛應(yīng)激建立內(nèi)臟高敏感模型[5-6]；NS對照組給予相應(yīng)0.9% NaCl溶液灌腸處理；空白對照組不予處理。

2.內(nèi)臟敏感性評估：實(shí)驗(yàn)第10天，以大鼠在下午2～5時(shí)之間的排便情況以及結(jié)直腸擴(kuò)張時(shí)腹壁回撤反射(AWR)評分為3分時(shí)所需的氣囊壓力作為評價(jià)內(nèi)臟敏感性的指標(biāo)[7]。

3.標(biāo)本采集：于乙酸灌腸后第2天隨機(jī)選取空白對照組和模型組大鼠各2只，給予3%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉后取距離肛門6 cm處的結(jié)腸組織1 cm。在模型建立成功后的實(shí)驗(yàn)第10天，各組大鼠經(jīng)3%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉后處死，70%乙醇浸泡10 min，無菌條件下剖開大鼠腹腔取脾臟和腸系膜淋巴結(jié)，碾磨后收集細(xì)胞懸液。

4.HE染色：取距肛門6 cm處的結(jié)腸組織，多聚甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，行HE染色，觀察大鼠黏膜損傷修復(fù)情況。

5.流式細(xì)胞術(shù)：調(diào)整細(xì)胞濃度為8×106～10×106/mL，用熒光標(biāo)記目標(biāo)抗體染色細(xì)胞，過濾，將濾液移入流式管，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，離心濃縮，重懸，培養(yǎng)，從腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞中篩選出DC，從脾臟淋巴細(xì)胞中篩選出CD4+T細(xì)胞。

6.MTT法：將分離得到的DC調(diào)整濃度至5×105/mL，與1.5×106/mL CD4+或CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)，收集上清液，使用MTT法檢測DC促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖的效果。

7.ELISA法：將分離得到的DC調(diào)整濃度至5×105/mL，與1.5×106/mL CD4+或CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)，仔細(xì)收集上清液，嚴(yán)格根據(jù)ELISA試劑盒說明書要求，檢測Th1途徑細(xì)胞因子IL-12、IFN-γ以及Th2途徑細(xì)胞因子IL-4、IL-9的分泌能力。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況

造模后，三組大鼠在第1～2天均表現(xiàn)出焦躁不安，大便稀水樣，肛周污染，有糞便殘留，飲水增多，進(jìn)食量明顯減少。第4～5天開始，空白對照組和NS對照組大鼠糞便水分減少，以軟便為主，偶可見稀便；模型組大鼠糞便水分亦較前減少，排便量和稀便發(fā)生率較其余兩組多見。第7天開始行束縛應(yīng)激時(shí)，空白對照組和NS對照組大鼠糞便以軟便為主，偶可見顆粒樣糞便，無稀便；模型組大鼠以軟便為主，偶可見顆粒樣糞便和稀便，排便量較其余兩組增加。在乙酸灌腸聯(lián)合束縛應(yīng)激實(shí)驗(yàn)完成后，NS對照組大鼠偶可見解稀便，肛周毛發(fā)糞便殘留，伴易激怒，聳毛現(xiàn)象；空白對照組大鼠肛周毛發(fā)清潔度良好，無明顯糞便污染，兩組大鼠進(jìn)食量和飲水量未見明顯異常，活動量無特殊改變，體質(zhì)量處于正常增長范圍；模型組大鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍，易激怒，聳毛，解稀便，軟便，肛周毛發(fā)糞便污染殘留，進(jìn)食量和飲水量減少，活動明顯減少，體質(zhì)量下降等表現(xiàn)。肉眼觀察和HE染色均未見大鼠結(jié)腸黏膜存在糜爛和潰瘍性病變。實(shí)驗(yàn)第10天，模型組大鼠軟便數(shù)和總便數(shù)明顯高于NS對照組和空白對照組(P<0.05；表1)。

表1 三組大鼠排便情況差異(實(shí)驗(yàn)第10天14時(shí)-17時(shí)排便情況)(n)

二、內(nèi)臟敏感性

AWR評分為3分時(shí)，模型組大鼠結(jié)直腸球囊擴(kuò)張的壓力明顯低于空白對照組和NS對照組(P<0.05)，而空白對照組與NS對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05;表2)。說明模型組內(nèi)臟敏感性明顯增高。

三、DC和脾臟CD4+T細(xì)胞分離結(jié)果

1.分離細(xì)胞表型測定結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示CD4+T細(xì)胞陽性率為92.46%±6.87%，臺盼藍(lán)染色顯示細(xì)胞活性>90%；DC由PE標(biāo)記OX62后流式分選所得，陽性率為97.46%±1.87%，臺盼藍(lán)染色顯示細(xì)胞活性>90%。

2.分離DC細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)：流式分選后所獲取的DC在體外常規(guī)培養(yǎng)后可見細(xì)胞表面典型樹枝狀凸起(圖1)。

圖1 流式分選所得DC和CD4+T細(xì)胞(箭頭所示為DC，其余為CD4+T細(xì)胞)

四、DC和脾臟CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)果

1.DC促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖效果：模型組CD4+T細(xì)胞的增殖能力顯著高于NS對照組和空白對照組(P<0.05)，而后兩組之間相比無明顯差異(表2)。說明模型組DC促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖的作用增強(qiáng)。

2.DC促CD4+Th0細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況：當(dāng)DC與CD4+Th0細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，模型組IL-4、IL-9分泌顯著高于NS對照組和空白對照組，IL-12分泌顯著減少(P<0.05)，而NS對照組與空白對照組之間無明顯差異。三組IFN-γ分泌水平無明顯差異，可能與實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定存在一定關(guān)系(表2)。

表2 三組大鼠內(nèi)臟敏感性、CD4+T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子比較

討 論

近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)腸道黏膜免疫功能異常對IBS-D的發(fā)病和內(nèi)臟高敏感的嚴(yán)重程度起有重要作用。IBS患者結(jié)腸黏膜中免疫細(xì)胞(DC、肥大細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞)數(shù)量增多，同時(shí)伴有相應(yīng)細(xì)胞因子(IL-4、IL-6、IL-9、TNF-α等)表達(dá)增加[1,8]。前期實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)IBS-D患者和大鼠血清、腸道黏膜DC數(shù)量明顯增多，黏膜肥大細(xì)胞浸潤增加，且其活化脫顆粒增強(qiáng)，同時(shí)伴有CD4+T細(xì)胞Th2免疫應(yīng)答途徑相關(guān)細(xì)胞因子IL-4、IL-9分泌明顯增加等現(xiàn)象[9]。然而IBS-D大鼠腸黏膜CD4+T細(xì)胞Th1/Th2途徑免疫應(yīng)答失衡現(xiàn)象及其與腸道DC之間的關(guān)系，以及對IBS-D大鼠內(nèi)臟高敏感的影響尚需行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)闡明。

APC在腸道黏膜免疫應(yīng)答中起有關(guān)鍵作用。在異常情況下，APC對抗原的敏感性增加，引起腸黏膜免疫反應(yīng)的異常激活和持續(xù)應(yīng)答[10]，從而在IBS的發(fā)病中起有重要作用。DC廣泛分布于黏膜固有層、腸道Peyer淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)以及全身血液、其他組織器官中，具有誘導(dǎo)Th0細(xì)胞活化的功能[2]，故在全身和黏膜免疫應(yīng)答過程中起極其重要的作用。DC通過向Th0細(xì)胞提供活化的第一、第二信號，誘導(dǎo)其向Th1和Th2亞群分化。在此過程中分別產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞因子輔助免疫應(yīng)答，包括Th1途徑的IL-2、IL-12、IFN-γ以及Th2途徑的IL-4、IL-9。

Th1免疫反應(yīng)表現(xiàn)為IFN-γ、IL-2和淋巴毒素-α分泌的增加，參與細(xì)胞免疫，可抵御細(xì)胞內(nèi)病原體如病毒、細(xì)菌、原蟲、真菌等[2]。Th2免疫反應(yīng)表現(xiàn)為IL-4分泌增加，輔助B細(xì)胞的激活和增殖，參與體液免疫，或促進(jìn)B細(xì)胞分泌大量IgE參與變態(tài)反應(yīng)，在抵御細(xì)胞外病原體的過程中起主要作用。在正常機(jī)體內(nèi)，當(dāng)外來病原體(如寄生蟲、細(xì)菌、病毒等)入侵腸道時(shí)，腸黏膜固有層的免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子通過Th1途徑和Th2途徑相輔相成，共同維持腸道黏膜免疫環(huán)境的穩(wěn)定，但Th1/Th2比例失衡時(shí)，容易誘發(fā)黏膜免疫功能的紊亂，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[11]。

Long等[12]的研究發(fā)現(xiàn)感染后腸易激綜合征小鼠腸道固有層DC在急性期與脾臟Th0細(xì)胞共培養(yǎng)后可產(chǎn)生Th2途徑免疫應(yīng)答，然而其未對IBS-D模型動物腸道Th1/Th2途徑免疫應(yīng)答失衡現(xiàn)象行進(jìn)一步研究和探討。

結(jié)合前期研究結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠經(jīng)提取的成熟DC促進(jìn)自體初始CD4+T細(xì)胞增殖的能力增強(qiáng)，兩者共培養(yǎng)時(shí)Th2途徑細(xì)胞因子IL-4和IL-9分泌量較NS對照組和空白對照組明顯增多，而Th1途徑細(xì)胞因子IL-12分泌量較兩組對照組減少。提示IBS-D大鼠腸道DC可能通過亢進(jìn)的抗原呈遞能力，介導(dǎo)脾臟CD4+Th0細(xì)胞活化，誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，從而導(dǎo)致黏膜Th2免疫應(yīng)答占絕對優(yōu)勢，Th1/Th2免疫應(yīng)答途徑失衡，產(chǎn)生明顯多于生理量的細(xì)胞因子IL-4、IL-9。

腸黏膜肥大細(xì)胞浸潤，活化、脫顆粒，以及相應(yīng)介質(zhì)的釋放是IBS-D患者產(chǎn)生內(nèi)臟高敏感的主要機(jī)制之一[13-14]。Th1/Th2免疫應(yīng)答途徑失衡，分泌亢進(jìn)的細(xì)胞因子IL-4、IL-9通過作用于肥大細(xì)胞在IBS-D的發(fā)病過程中扮演重要角色。IL-4是特異性促IgE生成的細(xì)胞因子，與肥大細(xì)胞的活化密切相關(guān)[15-16]。IL-9能增加肥大細(xì)胞表面FceRIα的表達(dá)，使肥大細(xì)胞處于更易被激活的狀態(tài)[17-18]。因此，細(xì)胞因子可能作為T細(xì)胞與肥大細(xì)胞之間的媒介，介導(dǎo)黏膜異常免疫應(yīng)答的發(fā)生。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IBS-D內(nèi)臟高敏感大鼠腸道黏膜DC數(shù)量增多，抗原呈遞功能亢進(jìn)，從而促進(jìn)自體CD4+T細(xì)胞過度增殖，并誘導(dǎo)Th0細(xì)胞主要向Th2細(xì)胞亞型分化，從而導(dǎo)致黏膜Th2免疫應(yīng)答占絕對優(yōu)勢，Th1/Th2免疫應(yīng)答途徑失衡，產(chǎn)生大量細(xì)胞因子IL-4、IL-9。進(jìn)一步引發(fā)了后續(xù)肥大細(xì)胞過度增殖、活化、脫顆粒的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感的發(fā)生。

同時(shí)，IBS-D大鼠腸道黏膜Th2免疫反應(yīng)異?？哼M(jìn)，使腸道黏膜抗外來病原體感染免疫過度應(yīng)答，黏膜維穩(wěn)修復(fù)功能可能下降。因此，Th1/Th2免疫平衡紊亂為IBS-D大鼠繼發(fā)腸道感染性疾病提供了免疫學(xué)基礎(chǔ)。未來將對IBS-D大鼠腸黏膜Th1/Th2免疫應(yīng)答途徑失衡所造成的抗病原微生物感染免疫失調(diào)現(xiàn)象行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，通過觀察正常大鼠、IBS-D大鼠與IBS-D繼發(fā)腸道感染大鼠腸道黏膜免疫細(xì)胞功能和數(shù)量以及相應(yīng)細(xì)胞因子的分泌量、各組大鼠內(nèi)臟敏感性等指標(biāo)，進(jìn)一步明確IBS-D大鼠在黏膜Th1/Th2免疫應(yīng)答途徑失衡基礎(chǔ)上所面臨的繼發(fā)腸道大腸埃希菌感染高風(fēng)險(xiǎn)，以及繼發(fā)感染后進(jìn)一步加重的免疫應(yīng)答紊亂現(xiàn)象，從而深入研究IBS患者繼發(fā)腸道大腸埃希菌感染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)以及對內(nèi)臟高敏感癥狀的影響。