徐朝久 趙景勝 龍劍 丁文信 吳紅花 梁靜

肺癌目前是我國(guó)發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤，并且由于工業(yè)化、環(huán)境污染等因素加重，肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)逐年攀升，肺癌，已經(jīng)成為不容忽視的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。而非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最常見的組織類型，早期難以診斷，多數(shù)患者確診時(shí)已處于進(jìn)展期，療效預(yù)后較差[2]。6-甲基腺嘌呤(m6A)是高等真核生物最關(guān)鍵的一種RNA修飾，經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶、組合蛋白及去甲基化酶調(diào)控后，能夠參與細(xì)胞凋亡、分化以及機(jī)體發(fā)育過(guò)程[3]。據(jù)報(bào)道甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3在肺癌等多種癌癥中出現(xiàn)異常表達(dá)，并且促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[4]。而METTL3與METTL14均能表現(xiàn)出甲基轉(zhuǎn)移酶活性，并且METTL14能表現(xiàn)出更高的酶活性[5]。目前鮮有關(guān)于METTL14與NSCLC之間聯(lián)系的臨床研究，因此我們本次研究將通過(guò)比較分析METTL14在NSCLC中的表達(dá)，探討METTL14對(duì)于NSCLC的臨床意義。

資料與方法

一、一般資料

選取2015年1月-2016年7月我院初診收治并行手術(shù)切除術(shù)的NSCLC患者64例，收集術(shù)中切除的癌變組織(研究組)及相應(yīng)的癌旁正常組織(對(duì)照組)?；颊吣挲g(29～75)歲，中位年齡為64.50歲，其中男44例，女20例。其他臨床資料(見表1)。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)所有患者均符合NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，且術(shù)前6個(gè)月內(nèi)未行放、化療及相關(guān)治療；2)組織標(biāo)本均經(jīng)病理科確診，癌旁正常組織與病灶距離>5cm； 3)經(jīng)超聲及支氣管鏡等影像學(xué)檢查，非處于妊娠期、哺乳期者或合并其他肺部疾病患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有其他系統(tǒng)惡性腫瘤及重要器官功能不全者。本次研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所獲組織標(biāo)本均經(jīng)生理鹽水清洗后，迅速分裝儲(chǔ)存于-80℃液氮中。

表1 NSCLC患者的一般臨床資料[n(%)]

二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)METTL14 mRNA表達(dá)

使用Trizol(美國(guó)INVITROGEN公司，15596018)提取組織中的總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo公司，K1622)說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司，iCycler iC)對(duì)目的序列進(jìn)行擴(kuò)增，TransStart Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司，AQ101-01)行qRT-PCR，引物序列均由上海吉瑪有限公司設(shè)計(jì)并合成(見表2)。反應(yīng)體系：cDNA 2μL，正反向引物各0.4μL，2*TransStart Green qPCR SuperMix 10μL，使用Nuclease-free Water將反應(yīng)體系補(bǔ)全至20μL。94℃預(yù)變性30s后采用兩步法進(jìn)行反應(yīng)： 94℃變性5s，60℃退火/延伸30s，共42個(gè)循環(huán)。設(shè)置3復(fù)孔，采用2-△△Ct計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表2 引物序列

三、Western blot檢測(cè)METTL14蛋白表達(dá)

使用RIPA(上海碧云天生物有限公司，P0013B)裂解并提取組織中的蛋白，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物有限公司，P0010S)檢測(cè)蛋白濃度并配置蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳后將甲醇活化的PVDF膜與凝膠夾一起放置于轉(zhuǎn)膜裝置中，100V常規(guī)穿膜90 min。然后將PVDF膜用5%脫脂奶粉，37℃封閉1 h，隨后分別加入METTL14、GAPDH抗體(美國(guó)abcam公司，ab220030、ab8245)稀釋，4℃下孵育過(guò)夜。次日使用PBS洗滌三次，每次10 min，隨后加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)IgG二抗(美國(guó)abcam公司，ab205719)，37℃，孵育2 h，PBS洗滌三次，每次10 min，最后使用ECL發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物有限公司，P0018)曝光顯影，使用QuantityOne軟件對(duì)掃描分析各條帶吸光度。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPad 8繪制所需圖片，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以%表示,組間比較采用卡方檢驗(yàn)。計(jì)量資料使用Mean±SD表示，組間比較使用配對(duì)t檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier生存曲線繪制NSCLC患者生存情況，并采用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行分析，采用多因素Cox回歸分析影響患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后因素，當(dāng)P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

一、METTL14 mRNA在NSCLC組織中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，METTL14 mRNA在研究組與對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量分別為(3.03±1.02)、(1.01±0.04)，METTL14 mRNA在NSCLC癌變組織中的表達(dá)較癌旁正常組織高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=15.629,P<0.001)(見圖1)。

圖1 METTL14 mRNA在NSCLC組織中的表達(dá)

二、METTL14 蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)

western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，METTL14 蛋白在研究組與對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.21±0.05)、(0.13±0.03)，NSCLC癌變組織中的METTL14 蛋白表達(dá)較癌旁正常組織中高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.874,P<0.001)(見圖2)。

圖2 METTL14 蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)

三、METTL14表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征之間的相關(guān)性

根據(jù)2.2中研究組METTL14蛋白表達(dá)的中位數(shù)0.21，將癌變組織分為METTL14高表達(dá)組、METTL14低表達(dá)組，每組32例，分析METTL14高、低表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNM Ⅲ+Ⅳ級(jí)、合并淋巴轉(zhuǎn)移的NSCLC患者M(jìn)ETTL14高表達(dá)的比例較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，METTL14高、低表達(dá)與患者的年齡、性別、病理類型以及吸煙史無(wú)關(guān)(P>0.05)(見表3)。

表3 METTL14表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征之間的相關(guān)性[n(%)]

四、METTL14表達(dá)與NSCLC患者生存及預(yù)后之間的關(guān)系

對(duì)64例患者進(jìn)行電話隨訪，平均隨訪時(shí)間為27.5(7～36)個(gè)月，METTL14高、低表達(dá)的NSCLC患者中位生存時(shí)間分別為23.5、34.5個(gè)月，總生存率分別為15.63%、46.88%，METTL14低表達(dá)的NSCLC患者預(yù)后優(yōu)于METTL14高表達(dá)患者(χ2=5.226，P<0.05)(見圖3)。隨后使用Cox多因素回歸模型分析NSCLC患者預(yù)后影響因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)METTL14高表達(dá)、TNM Ⅲ+Ⅳ級(jí)是影響NSCLC患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素(P均<0.05)(見表4)。

表4 Cox多因素回歸模型分析NSCLC患者預(yù)后影響因素

圖3 METTL14高、低表達(dá)NSCLC患者的生存曲線

討 論

NSCLC(非小細(xì)胞肺癌)作為全球癌癥死亡的主要原因，與其他癌癥一樣，其發(fā)生發(fā)展過(guò)程過(guò)程亦是涉及多種基因和途徑改變的多階段過(guò)程[8]。而m6A修飾是一種通過(guò)影響mRNA剪切、穩(wěn)定、翻譯等的RNA處理階段而調(diào)控細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄組標(biāo)記，其水平升高可能會(huì)改變細(xì)胞正常的分化途徑，導(dǎo)致細(xì)胞陷入祖細(xì)胞狀態(tài)，與肺癌、胰腺癌等實(shí)體瘤的獲得直接相關(guān)[9]。最近研究發(fā)現(xiàn)，m6A甲基化水平的降低，亦可以功能性抑制NSCLC細(xì)胞異常增殖和生長(zhǎng)[10]，這為NSCLC的治療提供潛在的治療方向。

甲基轉(zhuǎn)移酶是一種多樣的大蛋白家族，其特點(diǎn)為一種存在S-腺苷甲硫氨酸特定結(jié)合結(jié)構(gòu)域，目前已經(jīng)被證明能夠促使哺乳動(dòng)物RNA發(fā)生甲基化[11]，其中METTL3負(fù)責(zé)m6A形成[9]，METTL14是mRNA結(jié)合和穩(wěn)定所必需的的組成部分[10]，METTL3、METTL14能與Wilms腫瘤相關(guān)蛋白共同組成m6A[12]。并且METTL3與METTL14結(jié)合后的復(fù)合體可以誘導(dǎo)m6A在mRNA上沉積[11]。有趣的是，METTL3與METTL14必須保持在一個(gè)復(fù)合體中才能保持活躍[13]。Wang[14]等學(xué)者通過(guò)對(duì)METTL 3-14復(fù)合體的生化結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，Mettl14為METTL3在其活性中心附近提供了結(jié)構(gòu)上的支持，使METTL 3催化成為可能, METTL 3-14復(fù)合體的穩(wěn)定存在對(duì)在RNA底物中高效生產(chǎn)m6A具有至關(guān)重要的作用。因此METTL14通過(guò)激活METTL3，使得METTL3-14復(fù)合體具有更強(qiáng)的增強(qiáng)催化活性[5]。

本次研究通過(guò)采用qRT-PCR、western blot檢測(cè)METTL14在64對(duì)NSCLC癌變組織及癌旁正常組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)METTL14 mRNA與蛋白在NSCLC癌變組織中的表達(dá)較癌旁正常組織高，TNM Ⅲ+Ⅳ級(jí)、合并淋巴轉(zhuǎn)移的NSCLC患者M(jìn)ETTL14高表達(dá)的比例較高，METTL14高、低表達(dá)與患者的年齡、性別、病理類型以及吸煙史無(wú)關(guān)，這與之前的研究呈現(xiàn)一致性[15-16]。

此外，我們還分析了METTL14高、低表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后生存之間的聯(lián)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)METTL14低表達(dá)的NSCLC患者預(yù)后明顯優(yōu)于METTL14高表達(dá)患者。Cox回歸模型分析發(fā)現(xiàn)METTL14高表達(dá)、TNM Ⅲ+Ⅳ級(jí)是影響NSCLC患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。說(shuō)明METTL14高表達(dá)可能與NSCLC的預(yù)后不良相關(guān)，可能作為NSCLC預(yù)后篩查的一個(gè)分子靶標(biāo)，而Martin[17]等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)較高水平的METTL14，會(huì)導(dǎo)致編碼m6A符合蛋白的基因改變，METTL14的缺失會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，細(xì)胞周期停止，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分化，這也從側(cè)面輔證了我們的觀點(diǎn)： METTL14高表達(dá)暗示不良預(yù)后。

綜上所述，METTL14在NSCLC中過(guò)表達(dá)，METTL14可能參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，與患者預(yù)后息息相關(guān)，為NSCLC預(yù)后的評(píng)估提供了參考依據(jù)，這有助于我們對(duì)于m6A在NSCLC中的理解，可能成為NSCLC潛在的治療靶點(diǎn)。