田國(guó)英 徐磊

肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary hypertension，PH)是一類嚴(yán)重危害人類健康的疾病，可導(dǎo)致肺血管阻力和肺動(dòng)脈壓力的進(jìn)行性升高，從而發(fā)展為右心室肥厚，心力衰竭甚至死亡[1]。在過去幾十年間，雖然前列環(huán)素、內(nèi)皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑等靶向藥物的發(fā)現(xiàn)[2-3]推動(dòng)了PH患者的臨床治療，但這些藥物療效有限，價(jià)格昂貴，而且只能延遲病程進(jìn)展或緩解癥狀，無法有效延長(zhǎng)患者的長(zhǎng)期生存時(shí)間、降低疾病的死亡率[3]。此外兒童患者也給家庭帶來打擊和負(fù)擔(dān)[4]。因此研發(fā)新型的有效、適用、經(jīng)濟(jì)的肺動(dòng)脈高壓治療藥物具有十分重要的意義。近年來，有研究表明蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib，BTZ)對(duì)肺動(dòng)脈高壓模型動(dòng)物有較好的治療作用，但是其機(jī)制并不十分清楚。前期研究發(fā)現(xiàn)硼替佐米影響鈣池操縱性鈣內(nèi)流(store-operated Ca2+entry, SOCE)是其治療肺動(dòng)脈高壓的可能分子機(jī)制[5]。本研究將研究硼替佐米對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鈣池操縱性鈣通道(store-operated Ca2+channel，SOCC)組成蛋白TRPC1、6表達(dá)的影響并探討其分子機(jī)制。

資料與方法

一、主要試劑和儀器

倒置相差顯微鏡，為德國(guó)Leica公司產(chǎn)品。體式顯微鏡來自重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司。二氧化碳培養(yǎng)箱、三氣培養(yǎng)箱購自美國(guó)Thermo公司。硼替佐米、T0070907購自美國(guó)MCE公司。Cy3標(biāo)記二抗購自美國(guó)Jackson公司。TRPC1、TRPC6、PPARγ兔源性多克隆抗體購自美國(guó)Santa Cruz公司，β-actin小鼠源性單克隆抗體購自美國(guó)sigma公司。HRP標(biāo)記的羊抗兔及羊抗鼠二抗，均購于博士德公司。Ⅰ型膠原酶、木瓜酶、DTT購自美國(guó)Sigma公司。DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國(guó)GIBCO公司。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris堿、過硫酸銨、十二烷基硫酸鈉、甘氨酸、聚偏二氟乙烯膜、ECL化學(xué)發(fā)光液、蛋白電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)均為美國(guó)Bio-rad公司產(chǎn)品；RIPA細(xì)胞裂解液購于中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品，購于廣州試劑公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠10只，體質(zhì)量200～250 g，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，自由飲食。

2 原代培養(yǎng)遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 大鼠處死前稱體質(zhì)量，用3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，迅速取下心肺組織，置于預(yù)冷的有鈣HBSS溶液中，取出后，背側(cè)朝下固定心肺組織，加入適量有鈣HBSS液保持組織濕潤(rùn)，于體視鏡下用顯微外科剪去除血管旁結(jié)締組織分離出肺動(dòng)脈，用細(xì)胞刷輕輕刷除血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細(xì)胞，獲得大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌組織。將分離好的血管平滑肌層放入消化酶內(nèi)，置于37℃水浴箱內(nèi)消化約18～20 min，加入1 mL含10% FBS的培養(yǎng)基中止消化，1000 r/min離心3 min，小心吸棄上清液，加入2～3 mL的含10% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基，用1 mL槍頭小心吹打10～15次左右，使細(xì)胞懸浮。將細(xì)胞懸液接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，需要鑒定的細(xì)胞接種于放置有圓形蓋玻片的35 mm培養(yǎng)皿中，37℃細(xì)胞貼壁15～20 min，再補(bǔ)加適量培養(yǎng)基，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)[6]。

3 細(xì)胞處理 待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，將培養(yǎng)基換為含0.5% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基后再培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為常氧組、常氧+BTZ組、低氧組、低氧+BTZ組。常氧組及常氧+BTZ組置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。低氧組及低氧+BTZ組置于37℃、5%CO2、3%O2培養(yǎng)60 h。常氧+BTZ及缺氧+BTZ組在培養(yǎng)基內(nèi)加入BTZ，使終濃度為10nM。另一批細(xì)胞，分為低氧組、低氧+BTZ組、低氧+BTZ+T0070907組，前兩組處理同前，低氧+BTZ+T0070907組在培養(yǎng)基內(nèi)加入BTZ，終濃度為10nM；加入T0070907，終濃度為5nM。

4 TRPC1、TRPC6及PPARγ蛋白檢測(cè) 按文獻(xiàn)[7-8]使用蛋白免疫印跡法進(jìn)行檢測(cè)，培養(yǎng)后的細(xì)胞，迅速用預(yù)冷PBS洗滌3次，每皿加RIPA裂解液50 μL，用細(xì)胞刷充分刮擦細(xì)胞，然后將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，置于冰上；搖床上冰上繼續(xù)裂解30 min；4℃離心機(jī)12 000 rpm，離心30 min；測(cè)定蛋白濃度。各組蛋白按40 μg上樣，用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白，濃縮膠120 V，10 min，分離膠150 V，60 min；電轉(zhuǎn)法冰上轉(zhuǎn)膜，5%milk-TBST封閉1 h，一抗過夜，第二天用含0.1% tween 20的TBST洗膜3～5次后附二抗，常溫?fù)u床孵育1 h后再用含0.1% tween 20的TBST洗膜3～5次，然后ECL發(fā)光液顯影并X線膠片曝光。

結(jié) 果

1 硼替佐米對(duì)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果表明(見圖1A、C)，低氧組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1蛋白相對(duì)常氧組的表達(dá)量為(158±11)%(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。低氧+BTZ組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1蛋白的表達(dá)為常氧組的(112±8)%，與低氧組相比，低氧+BTZ組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

2 硼替佐米對(duì)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC6蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果表明(見圖1 A、D)，低氧組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC6蛋白相對(duì)常氧組的表達(dá)量為(146±9)%(P<0.01)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。低氧+BTZ組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC6蛋白的表達(dá)為常氧組的(107±6)%，與低氧組相比，低氧+BTZ組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC6蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

3 硼替佐米對(duì)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果表明(見圖1 A、B)，低氧組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞PPARγ蛋白相對(duì)常氧組的表達(dá)量為(65±7)%(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。低氧+BTZ組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞PPARγ蛋白的表達(dá)為常氧組的(98±6)%，與低氧組相比，低氧+BTZ組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞PPARγ蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

圖1 硼替佐米對(duì)大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)的TRPC1、TRPC6及PPARγ蛋白表達(dá)的影響

4 PPARγ抑制劑T0070907對(duì)硼替佐米介導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果表明(見圖2)，低氧+BTZ組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1蛋白相對(duì)低氧組的表達(dá)量為(65±7)%(P<0.01)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。低氧+BTZ+T0070907組與低氧+BTZ組相比，TRPC1蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.05); 低氧+BTZ組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC6蛋白相對(duì)低氧組的表達(dá)量為(71±5)%(P<0.01)，有著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。低氧+BTZ+T0070907組與低氧+BTZ組相比，TRPC6蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

圖2 PPARγ抑制劑T0070907對(duì)大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)的TRPC1、TRPC6蛋白表達(dá)的影響

討 論

肺動(dòng)脈高壓患病率約為全球人口的1%，65歲以上人群PH的患病率高達(dá)10%[9]。我們目前還沒有準(zhǔn)確的關(guān)于PH發(fā)病率的數(shù)據(jù)，中華慈善總會(huì)估算我國(guó)約有1200萬肺動(dòng)脈高壓患者。因此，肺動(dòng)脈高壓已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人民群眾健康的一大類疾病。在過去十年間，雖然前列環(huán)素、內(nèi)皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑等靶向藥物的發(fā)現(xiàn)[2-3]推動(dòng)了PH患者的臨床治療，但這些藥物療效有限，價(jià)格昂貴[3]。肺動(dòng)脈高壓的死亡率仍然繼續(xù)增長(zhǎng)，在女性患者每年增加2.5%，在男性患者每年增加0.9%[4]。因此研發(fā)新型的有效、適用、經(jīng)濟(jì)的肺動(dòng)脈高壓治療藥物具有十分重要的意義。

硼替佐米是水溶性丙氨基酸硼酸衍生物，是第一個(gè)應(yīng)用于臨床的蛋白酶體抑制劑，已用于治療多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、急性白血病、慢性粒細(xì)胞白血病和骨髓增生異常綜合征等[10-11]。近年來，有研究表明硼替佐米對(duì)肺動(dòng)脈高壓模型動(dòng)物有較好的治療作用[5,12-13]。其機(jī)制可能與影響平滑肌細(xì)胞一氧化氮信號(hào)通路和保護(hù)內(nèi)皮等有關(guān)[14-15]，但其機(jī)制仍然有待進(jìn)一步深入研究。張軍及我們前期研究者發(fā)現(xiàn)硼替佐米可以通過抑制低氧介導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡從而抑制肺血管異常收縮和重塑，對(duì)肺動(dòng)脈高壓起到治療作用。其具體的分子機(jī)制與硼替佐米可以抑制SOCC通道組成蛋白TRPC1、TRPC6及Orai1的表達(dá)有關(guān)[5,16]。本研究也驗(yàn)證了硼替佐米可以抑制低氧介導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1、6表達(dá)的上調(diào)。但硼替佐米是通過什么機(jī)制影響TRPC的表達(dá)有待進(jìn)一步的研究。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ配體激活 PPARγ 后，具有抗肥胖、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、腫瘤等疾病的有益作用，使得圍繞PPARγ 受體功能和配體篩選研究成為生物醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)研究的前沿?zé)狳c(diǎn)，成為治療上述頑疾的新的藥物靶標(biāo)。PPARγ活化后能夠抑制多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子分泌，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活性，抑制炎癥細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移，具有抗炎、抗增殖、促凋亡的特性，并增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素的靶細(xì)胞效應(yīng)，減輕氣道炎癥，防止氣道重構(gòu)[15]，肺動(dòng)脈高壓大鼠及特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者,肺內(nèi)及血管上PPARγ表達(dá)減少[10]。

過氧化物酶體活性增殖物受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor, PPARγ)與肺動(dòng)脈高壓的關(guān)系研究近年來引起研究者的重視[17]，血管上皮組織特異性敲除PPARγ小鼠,會(huì)自發(fā)肺動(dòng)脈高壓伴隨右心室肥大和遠(yuǎn)端小肺動(dòng)脈肌化。而靶向平滑肌PPARγ敲除的小鼠也會(huì)導(dǎo)致自發(fā)肺動(dòng)脈高壓[18]。Wang等[19]發(fā)現(xiàn)PPARγ在大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中可能通過抑制鈣池操作性鈣通道(SOCC)及TRPC表達(dá)發(fā)揮抗增殖、抗遷移、促凋亡的作用，而這些作用在缺氧或低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia inducible factor，Hif)1α累積的情況下被抑制。PPARγ可能通過抑制HIF-1α的表達(dá)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向調(diào)節(jié)SOCE和TRPC的表達(dá)，最終減緩慢性缺氧肺動(dòng)脈高壓。本研究發(fā)現(xiàn)硼替佐米可以抑制低氧介導(dǎo)的PPARγ表達(dá)的下調(diào)，提示硼替佐米可能是通過影響PPARγ參與TRPC表達(dá)的調(diào)節(jié)。

因此本研究應(yīng)用PPARγ特異性抑制劑T0070907刺激原代培養(yǎng)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)硼替佐米對(duì)低氧介導(dǎo)的TRPC1、TRPC6蛋白表達(dá)上調(diào)的抑制作用被抵消，說明硼替佐米可能是通過PPARγ參與TRPC表達(dá)的調(diào)節(jié)。這為闡明硼替佐米治療肺動(dòng)脈高壓的分子機(jī)制提供新的理論解釋：硼替佐米可能是通過PPARγ-TRPC-SOCE信號(hào)通路抑制低氧引起的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，從而達(dá)到治療肺動(dòng)脈高壓的作用。但硼替佐米對(duì)TRPC1、TRPC6表達(dá)的抑制作用是否只通過影響PPARγ起作用，還是與其發(fā)揮蛋白酶體抑制劑作用相關(guān)？另外硼替佐米影響PPARγ蛋白的表達(dá)的分子機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)硼替佐米可以通過調(diào)控PPARγ表達(dá)參與低氧引起的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1、6蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)，從而揭示了硼替佐米治療肺動(dòng)脈高壓的部分分子機(jī)制。