陸靜波，王穎異，彭 印，徐雪君，陳晨凱，段金廒，郭建明*

黃葵四物方對尿毒素分子硫酸對甲酚在宿主細(xì)胞內(nèi)代謝通路及轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)的影響

陸靜波1, 2，王穎異1, 2，彭 印1, 2，徐雪君1, 2，陳晨凱1, 2，段金廒1, 2，郭建明1, 2*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023 2 南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023

探討黃葵四物方對尿毒素分子硫酸對甲酚（-cresyl sulfate，PCS）在宿主細(xì)胞內(nèi)的代謝通路及轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)的影響，并初步探討其作用機(jī)制。采用超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀（ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole/mass spectrometry，UPLC-TQ/MS）檢測黃葵四物方干預(yù)后血漿及臟器內(nèi)PCS水平的變化。采用酶活法檢測肝臟內(nèi)PCS合成酶磺基轉(zhuǎn)移酶的活力。采用qRT-PCR及Western blotting檢測結(jié)腸和肝臟中磺基轉(zhuǎn)移酶及腎臟中有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平。黃葵四物方可降低動物血漿或肝臟中PCS水平。黃葵四物方顯著下調(diào)肝臟內(nèi)磺基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平（＜0.05），抑制肝臟中對甲酚向PCS轉(zhuǎn)化，從而抑制宿主體內(nèi)尿毒素分子PCS的合成。黃葵四物方不影響腎臟中有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平，不影響PCS由血液向腎臟中的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。黃葵四物方可通過調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)PCS的合成途徑，抑制PCS體內(nèi)合成，減少尿毒素蓄積，從而延緩慢性腎病進(jìn)程。

慢性腎??；尿毒素；硫酸對甲酚；黃葵四物方；磺基轉(zhuǎn)移酶；有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體

慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）是一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生問題，全球發(fā)病率約為10%，其中20%～30%的患者將會發(fā)展為終末期腎病，造成巨大的社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。全球疾病負(fù)擔(dān)研究表明，預(yù)計(jì)到2040年，CKD將成為導(dǎo)致人類死亡的第5大原因[3]。隨著CKD進(jìn)展，腎功能不斷衰竭，體內(nèi)代謝產(chǎn)生的氮質(zhì)廢物不能及時(shí)排出體外，在體內(nèi)不斷堆積形成的對機(jī)體有毒性的物質(zhì)稱作尿毒素。按照相對分子質(zhì)量及物理化學(xué)特性，可以將尿毒素分為小分子質(zhì)量尿毒素（如肌酐/尿素氮）和中分子質(zhì)量尿毒素（如甲狀旁腺素）和蛋白結(jié)合型尿毒素[4]。其中，蛋白結(jié)合型尿毒素因與血漿蛋白結(jié)合率高而命名，其相對分子質(zhì)量大，臨床透析治療不能將其去除，在終末期腎病患者體內(nèi)大量堆積，極大地降低了CKD患者的生活質(zhì)量和存活率[5]。

硫酸對甲酚（-cresol sulfate，PCS）是蛋白結(jié)合率高達(dá)95%的蛋白結(jié)合型尿毒素，終末期腎病患者體內(nèi)PCS含量超出正常人10倍[6]。過量的PCS在CKD患者體內(nèi)蓄積，進(jìn)一步加劇腎臟和心血管的損傷，加快CKD的進(jìn)展。PCS具有腎毒性，可誘導(dǎo)腎臟纖維化，加劇腎臟炎癥反應(yīng)[7]，誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞及腎小管近端細(xì)胞的凋亡，增加CKD患者的發(fā)病率和死亡率[8]。在心血管系統(tǒng)，PCS可刺激血管內(nèi)皮微粒子釋放，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，同時(shí)，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激，加劇CKD患者的血管損傷[9]。

中藥被認(rèn)為是一種成本低、效益高的治療手段，幾十年來，中藥治療慢性重大疾病的有效性和安全性研究取得了很大的進(jìn)展，越來越多的患者受益于中藥。本課題組在臨床治療CKD藥物黃葵膠囊的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化得到中藥復(fù)方黃葵四物方。該復(fù)方是由黃葵、黃芪、虎杖和姜黃4味中藥配伍而成。組方具有清利活血、通淋消腫、補(bǔ)瀉同施、標(biāo)本兼顧之功。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃葵四物方可顯著減輕CKD模型大鼠的腎臟炎癥及纖維化水平；顯著抑制CKD模型大鼠血漿、肝臟和腎臟中尿毒素分子PCS的蓄積[10]，提示黃葵四物方保護(hù)CKD的作用可能與其抑制體內(nèi)PCS蓄積相關(guān)。

PCS在宿主體內(nèi)合成及轉(zhuǎn)運(yùn)過程主要包括2個(gè)環(huán)節(jié)。PCS的合成環(huán)節(jié)：食物中的酪氨酸被腸道菌群分解產(chǎn)生對甲酚，對甲酚可在結(jié)腸和肝臟內(nèi)被磺基轉(zhuǎn)移酶（sulfotran-sferase1a1，SULT1A1）代謝合成PCS；PCS的轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)：血漿中的PCS經(jīng)由腎臟陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（organic anion transporter，OAT）轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腎臟細(xì)胞并最終通過尿液排泄[8]。最新研究表明，中藥通過干預(yù)腸道菌群可有效改善CKD、心血管疾病等多種慢性疾病[11-14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃葵四物方可作用于腸道菌群，調(diào)控腸道菌群中PCS前體分子對甲酚的合成途徑，抑制腸道菌群中對甲酚的合成。然而，黃葵四物方是否影響PCS在宿主細(xì)胞中的合成環(huán)節(jié)以及向腎臟內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)尚不清楚。因此，本研究進(jìn)一步探究黃葵四物方對尿毒素PCS在宿主細(xì)胞內(nèi)的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)的影響。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

ChemiDocXRS凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）；7500 Real Time PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用（Ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole/mass spectrometry，UPLC-TQ/MS）和高效液相色譜-紫外-熒光檢測器（high performance liquid chromatography-ultraviolet/fluorescence detector，HPLC-UV-FLD）均購自美國Waters公司；Microcl 21R常溫低速離心機(jī)（Thermo公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量18～25 g和SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（北京）2015-0001，動物合格號：NO.201807103。動物飼養(yǎng)在室溫20～26 ℃，相對濕度40%～70%，光照約12 h明暗交替的屏障環(huán)境動物房。每日提供符合標(biāo)準(zhǔn)的動物飼料及飲用水，供動物自由攝食和飲水。動物研究遵循南京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會的指導(dǎo)方針（倫理審核號201805A002）。

1.3 藥物及試劑

黃葵（批號180901）、黃芪（批號180401）、虎杖（批號180501）、姜黃（批號180201）均購于安徽省萬生中藥飲片有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定，符合《中國藥典》規(guī)定，均為正品。對甲酚（批號BCBR6678V）、PCS（批號3233-58-7）和腺苷-3′-磷酸-5′-磷酰硫酸鋰鹽水合物（adenosine-3′-phosphate-5′-phosphate lithium phosphate，PAPS，批號101154-201001）均購于美國Sigma- Aldrich公司。氯霉素（批號F1805109）、苯巴比妥鈉（批號2015062）購于中國材料研究中心。生理鹽水購于山東齊都藥業(yè)有限公司。Trizol試劑和引物購于美國Thermo Fisher Scientific公司；EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix和TransStart Top Green qPCR SuperMix購于北京全式金生物技術(shù)有限公司?？贵w購于美國Proteintech公司。質(zhì)譜級乙腈購于德國Merck公司。質(zhì)譜級甲酸購于天津科密歐有限公司。

2 方法

2.1 黃葵四物方溶液的制備

稱取適量黃葵、黃芪、虎杖、姜黃粉末，按照3.5︰5︰1.5︰1的比例混勻，60%乙醇提取3次，每次1.5 h，提取液合并進(jìn)行濃縮，濃縮后生藥量2 g/mL，其中主要藥效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為毛蕊異黃酮苷0.35 mg/g、虎杖苷2.54 mg/g、金絲桃苷3.90 mg/g、異槲皮苷2.56 mg/g、槲皮苷0.29 mg/g、楊梅素0.85 mg/g、白藜蘆醇13.42 mg/g、毛蕊異黃酮0.22 mg/g、槲皮素0.06 mg/g、姜黃素1.25 mg/g、大黃素0.54 mg/g。

2.2 PCS的UHPLC-TQ/MS分析

2.2.1 色譜條件 采用Acquity UHPLCTM系統(tǒng)、Acquity UHPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7mm）進(jìn)行色譜分析。流動相為0.1%甲酸水（A）和乙腈（B），具體色譜參數(shù)見表1。

2.2.2 質(zhì)譜條件 采用Xevo Triple Quadrupole Mass Spectrometer（TQ/MS）、選擇性反應(yīng)檢測法進(jìn)行質(zhì)譜分析。檢測參數(shù)：毛細(xì)管電壓為3.0 kV，離子源溫度為150 ℃，脫溶劑溫度為550 ℃，錐孔氣流速度為50 L/h，脫溶劑氣體積流量為1000 L/h。PCS質(zhì)譜檢測條件見表2。

表1 UPLC-TQ/MS檢測PCS的色譜條件

表2 UPLC-TQ/MS檢測PCS的質(zhì)譜條件

2.3 黃葵四物方對宿主體內(nèi)PCS合成的影響

2.3.1 黃葵四物方對小鼠體內(nèi)PCS含量的影響 將10只C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為2組，分別為正常組和黃葵四物方組，每組5只。對照組小鼠ig無菌超純水，黃葵四物方組小鼠ig黃葵四物方水溶液（2.5 g/kg[10]），連續(xù)ig 28 d。第28天，對照組和黃葵四物方組小鼠ig對甲酚（80 mg/kg），2 h后進(jìn)行眼眶取血。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠用苯巴比妥鈉（0.1 mL/10 g）麻醉，采集小鼠結(jié)腸和肝臟，脫頸椎處死小鼠。

將血液樣品4000 r/min離心10 min，離心后取上清即得血漿。稱取臟器樣品于EP管內(nèi)，每克樣品加入1 mL PBS溶液，60 Hz，90 s勻漿后，13 000 r/min離心10 min，取上清。所有樣品以10∶1比例加入200 μg/mL氯霉素作為內(nèi)標(biāo)物，再以1∶3比例加入乙腈，充分混勻，13 000 r/min離心10 min，取上清至進(jìn)樣小瓶中，置于冰上。按照“2.2”項(xiàng)的方法測定PCS含量。

2.3.2 黃葵四物方對小鼠肝臟中SULT1A1活性的影響 實(shí)驗(yàn)分組和給藥同“2.3.1”項(xiàng)。稱取各組小鼠肝臟，按1∶4（mg/L）的比例加緩沖溶液（將5 mmol/L的MgCl2·6H2O溶解在100 mmol/L pH 7.4的Tris-HCl中），2顆鋼珠，60 Hz、90 s勻漿，4 ℃，13 000 r/min離心20 min，取上清液。將上清液在37 ℃中孵育3 min，取240 μL上清液加10 μL 250 mol/L PAPS（3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸，底物，為對甲酚提供硫酸基團(tuán)，促進(jìn)對甲酚合成PCS），37 ℃孵育0、5、30、60 min，孵育完成后，加0.3 mL甲醇終止反應(yīng)。渦旋后離心（12 000 r/min、10 min），取上清液至進(jìn)樣小瓶。通過HPLC-UV-FLD分析上清液中PCS含量，采用C18柱（250 mm×4.6 mm，5mm，Alltima，美國），柱溫為35 ℃，進(jìn)樣時(shí)間為5.5 min，波長為260～300 nm，流動相為乙酸銨-乙腈（75︰25）。通過計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)PCS生成量反映小鼠肝臟中SULT1A1的酶活性。

2.3.3 黃葵四物方對小鼠結(jié)腸和肝臟中SULT1A1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)分組和給藥同“2.3.1”。將小鼠結(jié)腸、肝臟組織置于Trizol試劑中進(jìn)行研磨裂解，12 000×離心10 min，取上清，加入氯仿萃取靜置分層，12 000×離心15 min，取最上層溶液，加入異丙醇充分混勻，靜置，12 000×離心10 min，棄上層液體，加入75%乙醇渦旋，7500×離心5 min，取上清，3次，棄去液體，倒扣晾干，加入DEPC水復(fù)溶mRNA，并按照逆轉(zhuǎn)試劑盒說明書獲得互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）。使用PCR基因擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性30 s，然后進(jìn)入循環(huán)階段，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。最終以目的基因與甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的含量比值表示目基因的表達(dá)水平。使用的引物序列見表3。擴(kuò)增數(shù)據(jù)按照2?ΔΔCt的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

將小鼠的結(jié)腸、肝臟組織用RIPA裂解液以及蛋白酶抑制劑Cocktail進(jìn)行裂解，蛋白濃度用BCA試劑盒（Pierce Protein Biology，Rockford，IL，美國）進(jìn)行檢測。配制濃縮膠和10%的分離膠，并加入相同蛋白含量的樣品進(jìn)行樣品分離，用PVDF膜轉(zhuǎn)膜。5%牛奶室溫封閉PVDF膜1 h，封閉后用SULT1A1抗體（1︰1000）稀釋，4 ℃過夜孵育，然后用對應(yīng)的二抗進(jìn)行孵育，曝光，獲得目的蛋白及內(nèi)參蛋白（α-tubulin）的灰度值。

2.3.4 黃葵四物方對大鼠體內(nèi)PCS合成環(huán)節(jié)的影響 將15只SD雄性大鼠隨機(jī)分為3組，分別為對照組、對甲酚組和黃葵四物方組，每組5只。對照組大鼠每日上午ig生理鹽水1次，對甲酚組及黃葵四物方組大鼠每日上午ig對甲酚水溶液（40 mg/kg）1次，此外，黃葵四物方組大鼠每日下午ig黃葵四物方水溶液（1.25 g/kg[10]）1次，連續(xù)ig 10 d。第11天，ig對甲酚5 min后，黃葵四物方組ig黃葵四物方，1 h后眼眶取血，采集的血液置于含有15 g/L EDTA水溶液的EP管中。取血后，ip 2.0%苯巴比妥鈉溶液（30 mg/kg）麻醉大鼠。用4 ℃的PBS作為灌流液灌注。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠已經(jīng)死亡。采集大鼠結(jié)腸、肝臟和腎臟。血液和臟器樣品處理同“2.3.1”項(xiàng)，按照“2.2”項(xiàng)的方法測定PCS含量。

表3 大鼠和小鼠的靶基因引物

2.4 黃葵四物方對宿主體內(nèi)PCS轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

2.4.1 黃葵四物方對小鼠體內(nèi)PCS轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腎臟的影響 取C57BL/6雄性小鼠9只，隨機(jī)分為2組，對照組為4只，黃葵四物方組為5只。對照組每日ig生理鹽水1次；黃葵四物方組ig黃葵四物方水溶液（2.5 g/kg），連續(xù)ig 28 d。第28天，對照組和黃葵四物方組小鼠ip PCS（20 mg/kg），0.5 h后眼眶取血。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用2.0%苯巴比妥鈉（0.1 mL/10 g）麻醉小鼠，采集小鼠腎臟，脫頸椎處死小鼠。血液和臟器樣品處理同“2.3.1”項(xiàng)，按照“2.2”項(xiàng)的方法測定PCS含量。

2.4.2 黃葵四物方對小鼠腎臟中機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體OAT1/3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)分組和給藥同“2.4.1”項(xiàng)。取小鼠腎臟組織加入2顆鋼珠并用Trizol試劑進(jìn)行研磨裂解，12 000×離心10 min，取上清，加入氯仿萃取靜置分層，12 000×離心15 min，取最上層溶液，加入異丙醇充分混勻，靜置，12 000×離心10 min，棄上層液體，加入75%乙醇渦旋，7500×離心5 min，取上清，3次，棄去液體，倒扣晾干，加入DEPC水復(fù)溶RNA，儀器檢測。并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書轉(zhuǎn)錄得到互補(bǔ)的cDNA，最終使用PCR基因擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性30 s，然后進(jìn)入循環(huán)階段，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸30 s，共45 個(gè)循環(huán)。最后以目的基因與GAPDH的含量比值表示目基因的表達(dá)水平。使用的引物序列見表3。擴(kuò)增數(shù)據(jù)按照2?ΔΔCt的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

將小鼠的腎臟組織用RIPA裂解液以及蛋白酶抑制劑Cocktail進(jìn)行裂解，蛋白濃度用BCA試劑盒進(jìn)行檢測。配制濃縮膠和10%的分離膠，并加入相同蛋白含量的樣品進(jìn)行樣品分離，用PVDF膜轉(zhuǎn)膜。5%的牛奶室溫封閉PVDF膜1 h，封閉后用OAT1、OAT3抗體（1︰1000）稀釋，4 ℃過夜孵育，然后用相應(yīng)的二抗進(jìn)行孵育，曝光，獲得目的蛋白及內(nèi)參蛋白GAPDH的灰度值。

2.4.3 黃葵四物方對大鼠體內(nèi)PCS轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腎臟的影響 取SD雄性大鼠16只，隨機(jī)分為2組，分別為正常組和黃葵四物方組，每組8只。對照組ig生理鹽水，黃葵四物方組ig黃葵四物方（1.25 g/kg），連續(xù)ig 28 d。第28天，對照組和黃葵四物方組大鼠ip PCS（10 mg/kg），0.5 h后眼眶取血；取血后，ip 2.0%苯巴比妥鈉溶液（30 mg/kg）麻醉大鼠，在ip PCS 1 h后，對大鼠進(jìn)行腹主動脈取血，后用4 ℃的PBS作為灌流液灌注。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠已經(jīng)死亡，采集大鼠腎臟。血液和臟器樣品處理同“2.3.1”，按照“2.2”項(xiàng)的方法測定PCS含量。對大鼠腎臟中機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體OAT1/3 mRNA和蛋白表達(dá)量的測定同“2.4.2”項(xiàng)方法。

2.4.4 黃葵四物方對CKD模型大鼠腎臟中和mRNA表達(dá)的影響 將18只SD雄性大鼠隨機(jī)分為2組，模型組和黃葵四物方組各9只。制備CKD模型：兩組大鼠每日ig腺嘌呤溶液（200 mg/kg），連續(xù)ig 2周。造模結(jié)束后，各組大鼠靜養(yǎng)1周。1周后開始給藥，模型組每日ig超純水，黃葵四物方組每日ig黃葵四物方（1.25 g/kg），連續(xù)ig 56 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用2.0%苯巴比妥鈉溶液（30 mg/kg）麻醉大鼠，用4 ℃的PBS作為灌流液灌注。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠已經(jīng)死亡。采集大鼠腎臟。大鼠腎臟中機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體和mRNA表達(dá)量的測定同“2.4.2”項(xiàng)方法。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 黃葵四物方對宿主細(xì)胞內(nèi)PCS合成的影響

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃葵四物方可降低慢性腎病模型大鼠血漿、肝臟及腎臟中PCS的含量，但尚不明確黃葵四物方是干預(yù)了PCS的合成環(huán)節(jié)和/或抑制PCS向腎臟內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)，從而抑制宿主體內(nèi)PCS蓄積。因此，本研究首先針對結(jié)腸和肝臟內(nèi)PCS的合成環(huán)節(jié)，探討黃葵四物方對宿主細(xì)胞內(nèi)PCS合成的影響。

對甲酚ig給予小鼠后可被腸黏膜和肝臟中SULT1A1代謝生成PCS，小鼠血漿及腎臟內(nèi)PCS水平也相應(yīng)增加[4]，可進(jìn)一步觀察黃葵四物方對PCS合成環(huán)節(jié)的影響。黃葵四物方預(yù)給藥28 d后，各組小鼠ig對甲酚2 h后，利用UPLC-TQ/MS檢測小鼠血漿、結(jié)腸及肝臟內(nèi)PCS含量（圖1-A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，黃葵四物方可顯著降低小鼠血漿中PCS的含量（圖1-B），表明黃葵四物方可干預(yù)對甲酚向PCS轉(zhuǎn)化的過程。結(jié)腸和肝臟是對甲酚向PCS轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵部位，檢測結(jié)腸和肝臟中PCS含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃葵四物方對肝臟中PCS的蓄積具有一定的抑制趨勢（圖1-C），不影響腸道中PCS蓄積（圖1-D），以上結(jié)果提示黃葵四物方可能通過干預(yù)小鼠肝臟中PCS的合成，從而減少宿主體內(nèi)PCS蓄積。

文獻(xiàn)報(bào)道PCS主要由腸黏膜和肝臟內(nèi)SULT1A1代謝對甲酚生成[4]。因此，本研究進(jìn)一步分析黃葵四物方對腸道和肝臟中SULT1A1的影響（圖2-A）。利用Westen blotting和PCR方法檢測結(jié)腸和肝臟中SULT1A1基因和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，黃葵四物方對結(jié)腸內(nèi)基因的表達(dá)水平存在抑制趨勢（圖2-B），但不影響其蛋白水平的表達(dá)（圖2-C），提示黃葵四物方可能不影響腸道內(nèi)對甲酚向PCS轉(zhuǎn)化過程。黃葵四物方可顯著抑制肝臟內(nèi)SULT1A1基因和蛋白的表達(dá)水平（圖2-E、F）；此外，酶活力檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃葵四物方不影響肝臟內(nèi)SULT1A1的酶活力（圖2-D）。以上結(jié)果表明，黃葵四物方抑制小鼠體內(nèi)PCS蓄積可能與調(diào)控肝臟內(nèi)SULT1A1水平有關(guān)。

A-C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 B～D-黃葵四物方ig 28 d后小鼠血漿、肝臟和結(jié)腸內(nèi)PCS含量變化 與對照組較：*P＜0.05

A-宿主體內(nèi)對甲酚轉(zhuǎn)化為PCS的示意圖 B、C-黃葵四物方對小鼠結(jié)腸中SULT1A mRNA/蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響 D-黃葵四物方對小鼠肝臟中SULT1A活性的影響 E、F-黃葵四物方對小鼠肝臟中SULT1A mRNA/蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響 與對照組比較：*P＜0.05

為了對以上結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步觀察了黃葵四物方對大鼠體內(nèi)PCS合成環(huán)節(jié)的影響。大鼠ig對甲酚及黃葵四物方后，利用UPLC-TQ/MS檢測血漿、結(jié)腸、肝臟和腎臟內(nèi)PCS含量（圖3-A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組（未給予對甲酚）相比，對甲酚ig可顯著升高PCS在血漿和腎臟內(nèi)的含量，給予黃葵四物方后，大鼠血漿和腎臟內(nèi)PCS含量存在降低趨勢（圖3-B、C）。在結(jié)腸和肝臟的檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，對甲酚ig后可顯著增加大鼠結(jié)腸和肝臟內(nèi)PCS濃度，黃葵四物方可顯著降低肝臟內(nèi)PCS含量（＜0.05，圖3-D），但對結(jié)腸內(nèi)PCS含量無顯著影響（圖3-E）。以上結(jié)果表明，黃葵四物方不影響大鼠腸道中PCS的合成環(huán)節(jié)，但可抑制大鼠肝臟PCS的合成環(huán)節(jié)。黃葵四物方可干預(yù)對甲酚向PCS轉(zhuǎn)化的過程，減少體內(nèi)PCS蓄積。

A-SD大鼠實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 B～E-黃葵四物方和對甲酚ig 11 d后大鼠血漿、腎臟、肝臟和結(jié)腸內(nèi)PCS含量變化 與對甲酚組比較：*P＜0.05

3.2 黃葵四物方對宿主細(xì)胞內(nèi)PCS轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

為了觀察黃葵四物方對宿主體內(nèi)PCS轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)的影響，檢測小鼠ip PCS后，血漿及腎臟中PCS含量，從而直接反映黃葵四物方對PCS由血液向腎臟內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程的影響。小鼠ig給予黃葵四物方28 d后，ip PCS 0.5 h后收集血漿及腎臟，利用UPLC-TQ/MS檢測其中PCS含量（圖4-A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，黃葵四物含量度（圖4-B、C），提示黃葵四物方可能不影響PCS轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腎臟的環(huán)節(jié)。

文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，血漿中的PCS可通過腎臟內(nèi)有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體OAT1/3轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腎臟[4]。因此，進(jìn)一步觀察了黃葵四物方對腎臟OAT1/3轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，黃葵四物方對OAT3的基因轉(zhuǎn)錄存在抑制趨勢（圖4-E），但不影響其蛋白的表達(dá)水平（圖4-G）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，黃葵四物方可顯著抑制OAT1基因和蛋白的表達(dá)水平（圖4-D、F），提示黃葵四物方雖然可以抑制OAT1基因和蛋白的表達(dá)水平，但對PCS的腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)并無顯著影響。為了明確黃葵四物方對PCS轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)的影響，本研究在正常SD大鼠體內(nèi)進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

將正常大鼠進(jìn)行黃葵四物方預(yù)給藥28 d后，各組大鼠ip PCS，利用UPLC-TQ/MS檢測血漿及腎臟內(nèi)PCS含量（圖5-A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，黃葵四物方不影響血漿及腎臟內(nèi)PCS的含量（圖5-B～D）。大鼠腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體OAT1/3的檢測結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，黃葵四物方不影響大鼠腎臟OAT1/3的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平（圖5-E～G），提示黃葵四物方不影響正常大鼠體內(nèi)PCS轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腎臟。此外，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察了黃葵四物方對CKD模型大鼠體內(nèi)PCS轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腎臟的影響（圖5-H）。結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，黃葵四物方不影響CKD模型大鼠腎臟中OAT1/3的基因轉(zhuǎn)錄水平（圖5-I、J）。以上結(jié)果提示，黃葵四物方不影響大鼠體內(nèi)PCS轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腎臟。

A-C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 B、C-血漿和腎臟中PCS的含量 D、E-黃葵四物方對小鼠腎臟中OAT1和OAT3 mRNA表達(dá)水平的影響 F、G-黃葵四物方對小鼠腎臟中OAT1和OAT3蛋白表達(dá)水平的影響 與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

A-正常SD大鼠實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 B～D-血漿和腎臟中的PCS含量 E、F-黃葵四物方對大鼠腎臟中OAT1蛋白和mRNA表達(dá)水平的影響 G-黃葵四物方對大鼠腎臟OAT3 mRNA表達(dá)水平的影響 H-CKD模型大鼠實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 I、J-黃葵四物方對大鼠腎臟中OAT1和OAT3 mRNA表達(dá)水平的影響 與對照組比較：*P＜0.05

4 討論

CKD是由各種原因引起腎臟結(jié)構(gòu)和功能障礙的慢性疾病。根據(jù)腎小球?yàn)V過率（glomerular filtration rate，GFR）的水平將CKD分為了5個(gè)階段。隨著CKD進(jìn)程發(fā)展，患者腎功能下降，尿毒素不能及時(shí)排出體外，體內(nèi)大量蓄積的尿毒素會損傷患者腎功能，誘發(fā)心血管并發(fā)癥，進(jìn)一步加快CKD的進(jìn)展[15]。其中，PCS是當(dāng)前研究最多的尿毒素[4]。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，在人腎小管上皮細(xì)胞HK-2中，PCS可激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶，促進(jìn)活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，降低細(xì)胞生存力，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子mRNA水平升高和轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）蛋白分泌增加，最終導(dǎo)致腎臟損傷[16]。在心血管系統(tǒng)，PCS蓄積可增加尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶1nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 1，）、的基因表達(dá)，促進(jìn)ROS的生成，刺激氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化[17]；PCS還可直接激活胞外調(diào)解蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2），破壞胰島素通路，誘發(fā)胰島素抵抗[18]。因此，探索有效抑制體內(nèi)PCS生成和堆積的治療策略，對于延緩CKD進(jìn)展，降低CKD并發(fā)心血管事件具有重要意義。

黃葵四物方由黃葵、黃芪、虎杖和姜黃組成。方中黃葵清熱解毒，黃芪益氣消腫，虎杖利濕退黃，姜黃破瘀止痛。前期研究發(fā)現(xiàn)黃葵四物方能夠有效抑制CKD大鼠體內(nèi)尿毒素PCS蓄積，降低其血漿、肝臟及腎臟內(nèi)的PCS濃度。針對宿主細(xì)胞內(nèi)PCS代謝通路的各個(gè)環(huán)節(jié)，本研究設(shè)計(jì)了不同動物實(shí)驗(yàn)相互驗(yàn)證，分析黃葵四物方對宿主細(xì)胞合成及轉(zhuǎn)運(yùn)PCS的影響。將對甲酚ig給予小鼠，觀察黃葵四物方對小鼠體內(nèi)對甲酚向PCS合成轉(zhuǎn)化環(huán)節(jié)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃葵四物方可干預(yù)小鼠血漿及肝臟內(nèi)PCS的蓄積，但不影響結(jié)腸內(nèi)PCS含量。在肝臟特異性代謝酶的檢測中發(fā)現(xiàn)，黃葵四物方可顯著抑制肝臟內(nèi)SULT1A1基因和蛋白水平的表達(dá)，從而抑制SULT1A1催化對甲酚生成PCS。在大鼠體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃葵四物方可降低血漿、肝臟和腎臟內(nèi)PCS含量，其中對肝臟的抑制作用尤為顯著。以上結(jié)果說明，黃葵四物方抑制體內(nèi)PCS蓄積可能與調(diào)控肝臟內(nèi)SULT1A1有關(guān)。

在PCS轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)中，將PCS ip給予小鼠，研究黃葵四物方對PCS轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腎臟的影響。結(jié)果顯示，黃葵四物方不影響小鼠血漿和腎臟內(nèi)PCS的含量。在大鼠體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，同樣發(fā)現(xiàn)黃葵四物方不影響其血漿和腎臟內(nèi)PCS含量，且不影響腎臟內(nèi)OAT1/3 mRNA和蛋白的表達(dá)，即黃葵四物方不影響PCS通過OAT1/3轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腎臟。

綜上所述，黃葵四物方抑制對甲酚向PCS轉(zhuǎn)化，并最終減少體內(nèi)PCS蓄積這一作用可能與調(diào)控肝臟內(nèi)SULT1A1有關(guān)，但不影響結(jié)腸內(nèi)PCS的合成以及PCS向腎臟的轉(zhuǎn)運(yùn)（圖6）。

圖6 黃葵四物方對尿毒素分子硫酸對甲酚在宿主細(xì)胞內(nèi)代謝通路及轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)的影響

近年來，通過抑制尿毒素生成和/或調(diào)控其轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)減輕CKD腎臟損傷的治療策略具有廣闊發(fā)展前景，本研究以蛋白結(jié)合型尿毒素PCS的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)為切入點(diǎn)，探討黃葵四物方延CKD進(jìn)展的作用機(jī)制，為尋找治療CKD的新靶點(diǎn)，拓展治療CKD的新思路提供研究基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Webster A C, Nagler E V, Morton R L,. Chronic kidney disease [J]., 2017, 389(10075): 1238-1252.

[2] 宋建波, 廖暉, 李元平. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芪治療糖尿病腎病作用機(jī)制 [J]. 中草藥, 2020,51(11): 2988-2996.

[3] Foreman K J, Marquez N, Dolgert A,. Forecasting life expectancy, years of life lost, and all-cause and cause-specific mortality for 250 causes of death: Reference and alternative scenarios for 2016-40 for 195 countries and territories [J]., 2018, 392(10159): 2052-2090.

[4] Gryp T, Vanholder R, Vaneechoutte M,. P-Cresyl sulfate [J].(Basel), 2017, 9(2): E52.

[5] Deltombe O, van Biesen W, Glorieux G,. Exploring protein binding of uremic toxins in patients with different stages of chronic kidney disease and during hemodialysis [J].(Basel), 2015, 7(10): 3933-3946.

[6] Deltombe O, van Biesen W, Glorieux G,. Exploring protein binding of uremic toxins in patients with different stages of chronic kidney disease and during hemodialysis [J].(Basel), 2015, 7(10): 3933-3946.

[7] Brocca A, Virzì G M, de Cal M,. Cytotoxic effects of-cresol in renal epithelial tubular cells [J]., 2013, 36(3/4): 219-225.

[8] Lin H H, Huang C C, Lin T Y,.-Cresol mediates autophagic cell death in renal proximal tubular cells [J]., 2015, 234(1): 20-29.

[9] Gross P, Massy Z A, Henaut L,. Para-cresyl sulfate acutely impairs vascular reactivity and induces vascular remodeling [J]., 2015, 230(12): 2927-2935.

[10] 劉陽. 黃葵四物方對慢性腎病的保護(hù)作用及機(jī)理研究 [D]. 南京: 南京中醫(yī)藥大學(xué), 2018.

[11] 孫英新, 黃洋, 曾妙, 等. 基于“腸道菌群-炎癥”通路探討丹蔞片防治ApoE–/–小鼠動脈粥樣硬化的作用及機(jī)制 [J]. 中草藥, 2020, 51(9): 2492-2500.

[12] 湯齊, 高霞, 耿婷, 等. 腸道菌群與中藥相互作用的研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2017, 48(17): 3629-3635.

[13] 王穎異, 李建萍, 陸靜波, 等. 黃葵減輕慢性腎病模型大鼠體內(nèi)尿毒素蓄積的作用及機(jī)制研究 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 54(12): 2267-2276.

[14] 陸靜波, 王穎異, 張森, 等. 黃葵四物方調(diào)控腸道菌群中代謝通路干預(yù)尿毒素合成的作用機(jī)制研究 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 55(6): 1229-1236.

[15] Vanholder R, For the European Uremic Toxin Work Group (EUTox), de Smet R,. Review on uremic toxins: Classification, concentration, and interindividual variability [J]., 2003, 63(5): 1934-1943.

[16] Watanabe H, Miyamoto Y, Honda D,.-Cresyl sulfate causes renal tubular cell damage by inducing oxidative stress by activation of NADPH oxidase [J]., 2013, 83(4): 582-592.

[17] Jing Y J, Ni J W, Ding F H,.-Cresyl sulfate is associated with carotid arteriosclerosis in hemodialysis patients and promotes atherogenesis in apoE–/–mice [J]., 2016, 89(2): 439-449.

[18] Koppe L, Pillon N J, Vella R E,.-cresyl sulfate promotes insulin resistance associated with CKD [J]., 2013, 24(1): 88-99.

Effect of Huangkui Siwu Formula on metabolism and transportation pathway of urotoxin-cresyl sulfate

LU Jing-bo1, 2, WANG Ying-yi1, 2, PENG Yin1, 2, XU Xue-jun1, 2, CHEN Chen-kai1, 2, DUAN Jin-ao1, 2, GUO Jian-ming1, 2

1. Jiangsu Key Laboratory of High Technology Research of TCM Formulae, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

To investigate the effect and mechanism of action of Huangkui Siwu Formula (HKSWF, 黃葵四物方) on synthesis and transport pathways of urotoxin-cresyl sulfate (PCS).The concentration of PCS in plasma and organs interfered by HKSWF were determined by ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole/mass spectrometry (UPLC-TQ/MS). Enzyme activity method was used to detect the activity of sulfotransferase1a1 (SULT1A1). The gene transcription and protein expression of SULT1A1, organic anion transporter 1 (OAT1), and organic anion transporter 3 (OAT3) were tested by qRT-PCR and Western blotting.HKSWF could inhibit the conversion of-cresol to PCS in the liver by significantly down-regulating SULT1A1 gene transcription and protein expression levels (< 0.05), thereby interfering the synthesis of PCS in the host cell. The gene transcription and protein expression levels of organic anion transporters in the kidney were not affected by HKSWF, and HKSWF did not affect the transportation of PCS into the kidney.HKSWF can inhibit the formation of harmful urotoxin PCS by modulating the synthesis pathway of PCSand thereby delaying chronic kidney disease (CKD) progression.

chronic kidney disease; uremic toxins;-cresyl sulfate; Huangkui Siwu Formula; sulfotransferase; organic anion transporter

R285

A

0253 - 2670(2021)01 - 0176 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.021

2020-05-11

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81773983）；江蘇省研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（KYCX19_1315）

陸靜波（1995—），女，碩士生，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。E-mail: 15951878507@163.com

郭建明（1979—），男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)。E-mail: njuguo@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 潘明佳]