金愛，王宏鍵，董宇華，王旭東

(貴州醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院 生理學教研室，貴州 貴陽 550025)

乳腺癌(breast cancer)是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，也是女性最常見的激素依賴性惡性腫瘤，嚴重威脅著患者的身心健康[1-2]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一種生物學過程，可通過相應信號機制使上皮細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型的細胞[3]，EMT過程中的惡性腫瘤細胞往往可以獲得遷移和侵襲能力[3]，遷移和侵襲能力增強是乳腺癌轉(zhuǎn)移的必要條件[4]，亦提示有效抑制EMT可能是遏制乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)是女性體內(nèi)重要的性激素之一，正常生理狀態(tài)下，E2能調(diào)節(jié)乳腺的生長發(fā)育；而在惡性腫瘤中，E2可參與誘導多種腫瘤細胞的增殖、黏附、遷移及侵襲等生物學行為[5-6]；此外，E2還可誘導乳腺癌細胞發(fā)生EMT[7-8]。鈣蛋白酶(calpain)是一類依賴于Ca2+激活的中性蛋白酶超家族，其成員通過對底物進行“有限”切割，從而調(diào)整底物活性、并調(diào)節(jié)細胞生物學行為，如增殖、侵襲、遷移、骨架重構(gòu)等[9]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，E2可通過鈣蛋白酶誘導乳腺癌MDA-MB-468細胞遷移[10]。然而，關(guān)于鈣蛋白酶是否介導E2誘導的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細胞EMT和遷移目前尚不明了。因此，本研究通過分子生物學實驗深入探究鈣蛋白酶在E2誘導乳腺癌細胞遷移過程中的作用以及對EMT標志物纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)和E-鈣黏素(E-cadherin)蛋白表達的影響，為臨床治療乳腺癌提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗細胞與主要試劑 人雌激素受體(estrogen receptor，ER)陰性的乳腺癌細胞系MDA-MB-231和ER陽性的乳腺癌細胞系MCF-7(中國科學院上海細胞庫)，改良Eagle培養(yǎng)基(dulbecco’s modification of Eagle's medium，DMEM)、RPMI-1640培養(yǎng)基、抗生素(penicillin and streptomycin，美國Hyclone 公司)，胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS；杭州四季青公司)，E2和鈣蛋白酶抑制劑(calpeptin，美國Sigma公司)，蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF；武漢博士德生物)，抗FN多克隆抗體(美國Abcam公司)，羊抗小鼠IgG-HRP和羊抗小兔IgG-HRP(美國Santa Cruz公司)，抗E-cadherin多克隆抗體、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體(南京Bioworld公司)及蛋白濃度測試試劑盒(上海碧云天公司)。

1.1.2主要儀器 恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，SW-CJ-2FD超凈工作臺(中國蘇州凈化)，臺式超低溫高速離心機(美國Beckman Couler公司)，CKX41倒置顯微鏡(日本Olympus公司)及恒溫培養(yǎng)震蕩器(中國智城分析公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) MCF-7乳腺癌細胞培養(yǎng)于10%FBS、1%抗生素及89%RPMI-1640培養(yǎng)基中，MDA-MB-231乳腺癌細胞培養(yǎng)于10%FBS、1%抗生素及89%DMEM培養(yǎng)基中，所有細胞均培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2及飽和濕度(95%)培養(yǎng)箱。細胞培養(yǎng)24 h至對數(shù)生長期，用于后續(xù)實驗。

1.2.2劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取對數(shù)期生長的MCF-7和MDA-MB-231模型細胞分別鋪于12孔板，全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞至90%～100%，換無血清培養(yǎng)基同步化24 h，20 μL的無菌槍頭在12孔板皿底作十字劃痕，PBS清洗；分別加DMSO(對照組)、50 nmol/L E2(E2組)及50 nmol/L E2聯(lián)合10 μmol/L Calpeptin(E2+Calpeptin組)處理模型細胞，0、12、24 和48 h時標記區(qū)域進行拍照，記錄細胞劃痕區(qū)域?qū)挾龋嬎慵毎w移率[細胞遷移率=(0 h劃痕寬度-12 h或24 h或48 h劃痕寬度)/ 0 h劃痕寬度×100%][11]。

1.2.3蛋白印記實驗檢測模型細胞FN和E-cadherin表達變化 將對數(shù)期生長的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌模型細胞分別鋪于6孔板中，次日更換無血清培養(yǎng)基同步化24 h，待細胞匯合度達70%，分別加DMSO(對照組)、50 nmol/L E2(E2組)及50 nmol/L E2聯(lián)合10 μmol/L Calpeptin(E2+Calpeptin組)處理模型細胞，提取蛋白，配制含1 mmol/L蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA細胞裂解液于冰盒中裂解20 min，4 ℃離心機12 000 r/min離心15 min，吸取上清液至標記好的EP管進行蛋白定量；10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白(30 μg/泳道)，濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜；5%牛血清白蛋白室溫封閉1～2 h，TBST洗膜3次/10 min，然后加入抗FN多克隆抗體(1 ∶1 000)、抗E-cadherin多克隆抗體 (1 ∶1 000)室溫孵育2 h；TBST洗膜3次/10 min，加入相應二抗(1 ∶4 000)室溫孵育1 h，用凝膠成像儀進行成像拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 細胞遷移

與對照組相比，E2組MCF-7乳腺癌細胞24 h和48 h遷移率均有明顯增加，差異均有高度統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與對照組相比，E2組MDA-MB-231乳腺癌細胞24 h和48 h遷移均有明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

注：A、C為劃痕實驗結(jié)果(40×)，B、D為細胞遷移率的條圖；(1)與同時點對照組比較，P<0.01。圖1 E2誘導MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌細胞的遷移能力Fig.1 Migration of MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cells induced by E2

2.2 E2誘導的乳腺癌細胞E-cadherin和FN的表達

在MCF-7細胞中，與0 h相比，E2組細胞FN的表達在24 、48 和72 h均明顯上調(diào)，E-cadherin的表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其中48 h效果最佳；在MDA-MB-231細胞中，與0 h相比，E2組細胞FN的表達在24、48和72 h均明顯上調(diào)，E-cadherin的表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其中48 h效果最佳。見圖2。

注：A、C為Western blot實驗結(jié)果，B、D為相關(guān)蛋白定量表達的條圖；(1)與0 h比較，P<0.01。圖2 E2誘導MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌細胞的FN及E-cadherin蛋白表達Fig.2 Expression of FN and E-cadherin proteins in MCF7 and MDA-MB-231 human breast cancer cells induced by E2

2.3 Calpeptin抑制E2誘導的乳腺癌細胞遷移

與E2組相比，E2+Calpeptin組MCF-7細胞的24 h和48 h遷移率均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與E2組相比，E2+Calpeptin組MDA-MB-231細胞的24 h遷移率降低，48 h遷移率降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見圖3。

注：A、C為劃痕實驗染色結(jié)果(40×)，B、D為細胞遷移率的條圖；與同時點E2組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖3 Calpeptin抑制E2誘導MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌細胞的遷移能力Fig.3 Migration of MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cells induced by calpeptin-inhibited E2

2.4 Calpeptin抑制E2誘導的模型細胞E-cad和FN的表達

在MCF-7細胞，與E2組相比，E2+Calpeptin組FN表達顯著下調(diào), E-cad表達顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；在MDA-MB-231細胞，與E2組相比，E2+Calpeptin組FN明顯表達下調(diào)，E-cadherin表達明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖4。

注：A、C為Western blot實驗結(jié)果，B、D為相關(guān)蛋白定量表達的條圖；(1)與E2組比較，P<0.01。圖4 Calpeptin抑制E2誘導MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌細胞的FN和E-cadherin蛋白表達Fig.4 Expression of FN and E-cadherin in MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cells induced by calpeptin-inhibited E2

3 討論

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，E2處理組MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細胞在24和48 h的遷移率均明顯增加，細胞中FN蛋白在24、48和72 h表達均明顯上調(diào)，而E-cadherin蛋白表達則明顯下調(diào)；與E2組相比，E2+Calpeptin組MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細胞的遷移率明顯下降，F(xiàn)N表達明顯減少，E-cadherin表達明顯增加。因此提示Calpain在E2介導的乳腺癌細胞遷移和EMT過程中發(fā)揮著重要的作用。

乳腺癌是常見的惡性腫瘤，是女性腫瘤相關(guān)性死亡的最常見原因，全球每年大約有138萬的新發(fā)病例，每年約45.8萬死于乳腺癌疾病[12]。盡管隨著治療水平的提高，乳腺癌的致死率每年逐漸下降，但致死率仍在15%以上[13]。乳腺癌嚴重危害女性的健康，因此乳腺癌的防治是當今研究者最迫切關(guān)注的問題。

乳腺癌是經(jīng)典的激素依賴性的惡性腫瘤，許多研究已經(jīng)證實E2調(diào)控乳腺癌的多種惡性行為如遷移、轉(zhuǎn)移等[6]。E2可以通過上調(diào)多個原癌基因如多配寡糖1(syndecan 1)[14]、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)[15]促進乳腺癌的進展。與之前研究一致，本研究以ER陽性的MCF-7乳腺癌和ER陰性的MDA-MB-231乳腺癌細胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)E2能夠顯著促進MCF-7和MDA-MB-231細胞的遷移。乳腺癌患者死亡的主要原因可能與乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)[16]，轉(zhuǎn)移是幾乎所有乳腺癌死亡的主要原因，乳腺癌的繼發(fā)性生長主要發(fā)生在淋巴結(jié)，骨骼，肝臟，肺和大腦中，而腫瘤細胞轉(zhuǎn)移涉及細胞脫落、遷移、侵襲、黏附及血管生成等多個生物學過程[17]；已有研究表明乳腺癌細胞EMT伴隨遷移和侵襲活動增強[18]；FN表達上調(diào)和E-cadherin的減少或丟失被認為是EMT的重要標志, 臨床研究也顯示，EMT標志物E-cadherin和波形蛋白與乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移存在明顯相關(guān)性[19-20]。這些研究均提示，EMT是引起乳腺癌遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移的重要因素。進一步通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，E2可以顯著誘導MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細胞FN蛋白表達上調(diào)和E-cadherin蛋白的表達下調(diào)。

大量研究已經(jīng)證實，鈣中性蛋白酶calpain在乳腺癌的增殖、遷移和侵襲過程中扮演著重要的角色。本課題組前期工作表明，雌二醇E2激活 MCF-7乳腺癌細胞中鈣蛋白酶calpain，持續(xù)地誘導細胞周期蛋白E(cyclin E)的表達增加，進而調(diào)控乳腺癌細胞的惡性增殖[21]。鈣蛋白酶包括多種亞型分子，廣泛表達的鈣蛋白酶分為μ-鈣蛋白酶(Calpain1)和m-鈣蛋白酶(Calpain2)，Calpeptin可抑制Calpain1和Calpain2[22]。同樣，本課題組前期實驗也發(fā)現(xiàn)，Calpeptin預處理可抑制E2誘導的MDA-MB-468乳腺癌細胞遷移[10]。為進一步探討，鈣蛋白酶Calpain是否調(diào)控E2介導的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細胞的EMT和遷移過程，我們應用鈣蛋白酶抑制劑Calpeptin預處理細胞。與前期實驗結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)Calpeptin預處理可抑制E2介導的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細胞的遷移以及EMT過程。提示，E2可通過調(diào)控鈣蛋白酶Calpain促進多種類型的乳腺細胞EMT和遷移。

綜上所述，E2可能誘導ER陽性乳腺癌細胞MCF-7和ER陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231 EMT和遷移，上述效應可能與Calpain的介導作用相關(guān)，提示鈣蛋白酶Calpain是一個潛在的治療靶點。