王婷婷， 劉 梁， 曹秀明， 王清清，

(1. 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))， 江蘇 無(wú)錫 214122； 2. 江蘇陽(yáng)光股份有限公司， 江蘇 無(wú)錫 214400)

抗生素在全球范圍內(nèi)的濫用，使金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等細(xì)菌對(duì)抗生素表現(xiàn)出越來(lái)越強(qiáng)的耐藥性[1-2]，因此，近年來(lái)關(guān)于新型抗菌方法的研究受到廣泛關(guān)注。光動(dòng)力抗菌化學(xué)療法(PACT)[3]具有廣譜抗菌性，且不會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的特點(diǎn)，其原理是在可見(jiàn)光照射下，光敏劑在有氧條件下產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的活性氧物質(zhì)來(lái)使微生物失活。相較于傳統(tǒng)抗菌方法，該療法所使用的光敏劑毒副作用低，在有效殺滅微生物的同時(shí)，不會(huì)使其產(chǎn)生抗性，且抗菌(包括細(xì)菌、真菌及病毒在內(nèi)的多種微生物)范圍廣，具有良好的研究前景[4]。常見(jiàn)的光敏劑有卟啉類(lèi)光敏劑、陽(yáng)離子型光敏劑、酞菁類(lèi)光敏劑、玫瑰紅等[5]。

竹紅菌素(Hc)是從竹紅菌中提取的天然光敏劑，其組分主要有2種，竹紅菌甲素和竹紅菌乙素[6-7]。竹紅菌素具有原料易得，提純過(guò)程簡(jiǎn)單，三重態(tài)和單重態(tài)氧量子產(chǎn)率高，光毒性高而暗毒性低，體內(nèi)清除速度快等優(yōu)點(diǎn)[8],是一種前景較好的天然光敏劑，市售的云南白藥集團(tuán)生產(chǎn)的竹紅菌素軟膏目前已用于治療多種皮膚病。光敏劑在固體材料上的固定為其使用提供了便利，目前，關(guān)于光敏劑竹紅菌素的固定化已有大量研究，如固定在脂質(zhì)體[9-10]、納米顆粒[11-13]等材料上，但對(duì)其在靜電紡納米纖維材料上的固定化及其抗菌性能評(píng)價(jià)方面的研究并不多。

靜電紡納米纖維具有比表面積髙、纖維直徑細(xì)，吸附性好等優(yōu)異性能，其所用原料來(lái)源廣泛，具有良好的可加工性，且在一定程度上對(duì)抗菌效率有提高作用[14-15]，故竹紅菌素在靜電紡絲膜上的負(fù)載具有較好的研究意義。本文采用靜電紡絲法制備含竹紅菌素的聚(甲基丙烯酸甲酯-co-甲基丙烯酸)(P(MMA-co-MAA))納米纖維膜(Hc-PM)，并對(duì)納米纖維的形態(tài)、表面微觀結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性、單線態(tài)氧的產(chǎn)生以及底物氧化性能進(jìn)行研究，最后評(píng)價(jià)了該材料對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的光敏抗菌效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

材料：聚(甲基丙烯酸甲酯-co-甲基丙烯酸)[16]，實(shí)驗(yàn)室自制；竹紅菌素，江南大學(xué)生物工程學(xué)院；三氯甲烷(CHCl3，分析純)、二甲基甲酰胺(DMF，色譜純)、碘化鉀(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮(TEMP)、重水(D2O)，上海維塔化學(xué)試劑有限公司；金黃色葡萄球菌(ATCC-6538)及大腸桿菌(8099)，上海協(xié)久生物科技有限公司。

儀器：靜電紡絲裝置，實(shí)驗(yàn)室自制；UH4150型紫外-可見(jiàn)-近紅外分光光度計(jì)、SU1510型掃描電子顯微鏡(SEM)，日本日立株式會(huì)社；UV-2600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津制作所；DCAT-21型表-界面張力儀，德國(guó)Dataphysics公司；NICOLET IS10型傅里葉變換紅外光譜儀，中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；Q500型熱重分析儀，美國(guó)TA公司；XQ500 W型可調(diào)型氙燈電源，上海藍(lán)晨電子有限公司；EMX plus-10/12型電子順磁共振波譜儀，德國(guó)布魯克科技有限公司；BSP-150型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 紡絲溶液的制備

紡絲液溶質(zhì)P(MMA-co-MAA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，質(zhì)量為2 g，溶劑DMF與CHCl3的質(zhì)量比為3∶7，二者混合后分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0%、0.1%、0.3%、0.5%的光敏劑竹紅菌素，避光置于磁力攪拌器上常溫?cái)嚢?0 h至完全溶解得到紡絲液。

1.3 納米纖維膜的制備

將紡絲液倒入表面覆有錫紙的規(guī)格為20 mL的注射器中，并安裝在注射泵上，在針頭上加上正電勢(shì)使紡絲液表面帶正電荷。在高壓靜電場(chǎng)作用下通過(guò)靜電紡絲機(jī)進(jìn)行紡絲，紡絲液所受電場(chǎng)力克服溶液表面張力后，噴射出帶電射流，隨著溶劑的揮發(fā)，固化為纖維隨機(jī)排布于收集裝置上[17]。靜電紡絲工藝條件為：室溫，避光，紡絲電壓19 kV，注射泵控制溶液流速1 mL/h，紡絲接收距離15 cm，用覆有錫紙的滾筒作為接收裝置。通過(guò)實(shí)驗(yàn)分別紡得不含竹紅菌素的PM膜及不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)Hc-PM納米纖維膜。

1.4 測(cè)試與表征

1.4.1 形貌觀察及親疏水性測(cè)試

將制得的納米纖維膜真空干燥后粘貼在樣品臺(tái)上，為降低其表面放電效應(yīng)，進(jìn)行噴金處理。用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察纖維的表面形貌和結(jié)構(gòu)，掃描電壓為5 kV。

利用Acrobat測(cè)量軟件，取SEM照片中相同面積范圍內(nèi)100段纖維進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算其平均直徑及標(biāo)準(zhǔn)差。

采用表-界面張力儀測(cè)試材料的靜態(tài)接觸角，對(duì)材料親疏水性進(jìn)行表征，進(jìn)一步分析其表面結(jié)構(gòu)。

1.4.2 納米纖維膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)測(cè)試

利用紫外-可見(jiàn)-近紅外分光光度計(jì)對(duì)納米纖維膜進(jìn)行掃描；配制濃度為0.1 mmol/L的竹紅菌素溶液，利用紫外-可見(jiàn)分光分度計(jì)對(duì)其進(jìn)行掃描得到光譜圖，掃描波段均為350～700 nm。

采用傅里葉變換紅外光譜儀中衰減全反射紅外光譜法(ATR-FT-IR)測(cè)試分析納米纖維膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)。測(cè)試分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為16，波數(shù)范圍為4 000～525 cm-1。

1.4.3 納米纖維膜的熱力學(xué)性能測(cè)試

采用熱失重分析儀(TG)對(duì)納米纖維膜的熱力學(xué)性能進(jìn)行測(cè)試分析。將樣品(約6 mg)置于氧化鋁坩堝內(nèi)，進(jìn)行程序升溫：初始溫度為30.0 ℃，升溫速率為10.0 ℃/min，最終溫度為800.0 ℃，載氣為氮?dú)?，其流速?0.0 mL/min。

1.4.4 單線態(tài)氧的電子順磁共振信號(hào)測(cè)試

利用電子順磁共振波譜儀探測(cè)納米纖維膜經(jīng)光照后是否有單線態(tài)氧生成。將Hc-PM納米纖維膜置于溫度為60 ℃的干燥箱中，烘燥3 h，剪成2 cm×2 cm規(guī)格，隨后將其分別加入含有14 μmol TEMP的3 mL氧飽和D2O溶液中，在可見(jiàn)光(光強(qiáng)為65 mW/cm2，波長(zhǎng)為420～780 nm)條件下照射1 h；然后將所得溶液轉(zhuǎn)移到石英毛細(xì)管中，固定在波譜儀的諧振腔中測(cè)試得到樣品的電子順磁共振(EPR)信號(hào)波譜。測(cè)試條件為：在0.335 T的中心場(chǎng)和0.007 T的掃頻寬度的磁場(chǎng)下操作，微波頻率9.17 GHz，功率10 mW，信號(hào)通道的掃描時(shí)間0.128 s。

1.4.5 納米纖維膜的氧化性能

通過(guò)底物KI溶液在光照條件下的吸光度變化來(lái)判斷樣品的氧化能力。將PM及Hc-PM納米纖維膜置于溫度為60 ℃的干燥箱中，烘燥3 h，并剪成1 cm×1 cm規(guī)格，分別置于20 mL濃度為0.1 mol/L的 KI溶液中，在可見(jiàn)光(光強(qiáng)為65 mW/cm2，波長(zhǎng)為420～780 nm)照射下，每隔5 min用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量1次溶液吸光度。

1.4.6 光動(dòng)力抗菌性能評(píng)價(jià)

參考AATCC 100—2012《抗菌紡織品的評(píng)價(jià)方法》對(duì)Hc-PM納米纖維膜進(jìn)行抗菌性能評(píng)價(jià)。

將干燥的PM以及Hc-PM纖維膜分別裁為若干個(gè)形狀、厚度均一的圓形試樣，置于24孔板內(nèi)。取0.1 mL濃度為1～3×108CFU/mL的菌液(PBS緩沖液)接種于各樣品上，將各組樣品分別置于光照(光強(qiáng)為65 mW/cm2，波長(zhǎng)為420～780 nm)及暗室條件中培養(yǎng)30 min后，取0.9 mL的PBS緩沖液于24孔板中，振蕩搖勻后，取0.1 mL原菌液及試樣上的菌液，加入0.9 mL PBS緩沖液，依次等梯度稀釋1×106倍。分別從各稀釋梯度的溶液中取10 μL滴在培養(yǎng)基平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃)中培養(yǎng)24 h。最后記錄其菌落數(shù)計(jì)算抑菌率S。

式中：N0為原菌液可計(jì)數(shù)列的菌落最大值；Ni為試樣抗菌后與原菌液對(duì)應(yīng)梯度下的菌落值。

2 結(jié)果與討論

2.1 形貌及親疏水性分析

竹紅菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.0%、0.1%、0.3%、0.5%的納米纖維膜的掃描電鏡照片如圖1所示，通過(guò)Acrobat軟件測(cè)量納米纖維的直徑如表1所示。

圖1 不同Hc質(zhì)量分?jǐn)?shù)的納米纖維膜的 SEM照片(×5 000)Fig.1 SEM images of nanofibrous membranes with different Hc concentrations(×5 000)

表1 PM和Hc-PM納米纖維膜的直徑分布Tab.1 Diameters of PM and Hc-PM nanofibrous membrances

由圖1和表1可知，PM膜中納米纖維直徑粗細(xì)均勻，表面光潔，隨機(jī)取向分布形成精細(xì)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；添加竹紅菌素后，Hc-PM膜中納米纖維粗細(xì)不勻程度增加，纖維表面有粗節(jié)，這是因?yàn)橹窦t菌素為脂溶性有機(jī)分子，在含極性溶劑DMF的紡絲液中易自發(fā)聚集[18]。隨著竹紅菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，Hc-PM納米纖維的平均直徑越來(lái)越粗，纖維間略有黏連，這是由于脂溶性竹紅菌素添加后紡絲液的濃度、黏度增加，電導(dǎo)率下降，紡絲液在靜電場(chǎng)中所受到的牽伸力降低的緣故[19]。相較之下，Hc-PM中納米纖維的橫截面比PM中納米纖維不規(guī)則，且直徑不勻度也較高。

材料本身的性質(zhì)，表面形態(tài)及直徑分布對(duì)其親疏水性會(huì)產(chǎn)生一定影響。經(jīng)靜態(tài)水接觸角測(cè)試可知，PM及Hc質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的Hc-PM納米纖維膜的接觸角分別為109.2°和131.4°，均表現(xiàn)為疏水性。由于竹紅菌素具有疏水性，故添加了竹紅菌素的Hc-PM膜的疏水性更佳[20]。另外，對(duì)于疏水性材料，表面較大的粗糙度有利于其截留更多的空氣，從而增大接觸角[21]?？傮w來(lái)說(shuō)，Hc-PM納米纖維更不規(guī)則，直徑不勻度更高，表面粗糙度更大，故Hc-PM膜接觸角更大，疏水性更好。

2.2 化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)紫外光譜及紅外光譜探究竹紅菌素于纖維膜上的負(fù)載方式，結(jié)果分別如圖2、3所示。圖中Hc-PM納米纖維膜的Hc質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%。

圖2 竹紅菌素溶液和納米纖維膜的紫外光譜圖Fig.2 UV-vis spectra of Hc solution and nanofibrous membranes

圖3 PM和Hc-PM納米纖維膜的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR of PM and Hc-PM nanofibrous membranes

天然光敏劑竹紅菌素主要有2種組分：竹紅菌甲素和竹紅菌乙素，其中95%以上為竹紅菌甲素，本文實(shí)驗(yàn)所用竹紅菌素為混合物。由圖2可知，PM膜在350～700 nm波段無(wú)特征峰，Hc溶液有3個(gè)竹紅菌素的典型特征峰，分別為468.5、528.0和571.0 nm；同樣地，Hc-PM也有3個(gè)特征峰，分別為465.0、530.0和571.0 nm，與Hc溶液相符。這說(shuō)明Hc-PM膜中負(fù)載有竹紅菌素，且其化學(xué)組分沒(méi)有因靜電紡絲過(guò)程而改變。

2.3 熱力學(xué)性能分析

通過(guò)熱重分析研究PM及Hc質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的Hc-PM納米纖維膜的熱學(xué)性能，結(jié)果如圖4所示?？芍涸?50 ℃前，納米纖維膜有較小的質(zhì)量損失，主要是由于聚合物中含有的水分和小分子物質(zhì)等雜質(zhì)的去除，以及纖維膜側(cè)鏈基團(tuán)的初步降解；在300～450 ℃范圍內(nèi)，納米纖維膜骨架開(kāi)始降解[7]，使其質(zhì)量明顯下降，在450 ℃達(dá)到完全降解。比較2條曲線可知，竹紅菌素的加入使納米纖維膜骨架降解的初始降解溫度由302 ℃降至292 ℃，最大降解速率溫度由426 ℃降至412 ℃，降解速度稍稍變快，說(shuō)明竹紅菌素的加入使得纖維膜的熱穩(wěn)定性下降，但影響較小。

圖4 PM和Hc-PM膜的熱穩(wěn)定性曲線Fig.4 TG(a)and DTG(b)curves of PM and Hc-PM nanofibrous membranes

2.4 單線態(tài)氧的電子順磁共振信號(hào)分析

光敏劑竹紅菌素經(jīng)光照后躍遷至激發(fā)態(tài)，將分子氧轉(zhuǎn)化為具有高反應(yīng)活性、高氧化性的單線態(tài)氧(1O2)。由于1O2的壽命較短，因此，可用捕獲劑2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮(TEMP)捕獲1O2生成2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮-N-氧化物自由基(TEMPO)，通過(guò)檢測(cè)TEMPO的電子順磁共振(EPR)信號(hào)來(lái)判斷是否有1O2生成[22]。Hc質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的Hc-PM膜經(jīng)光照后產(chǎn)生的EPR信號(hào)如圖5所示。

圖5 光照Hc-PM膜與TEMP生成的TEMPO的EPR信號(hào)Fig.5 EPR signal of TEMPO generated by Hc-PM membrane and TEMP after illumination

由圖5可知，純D2O空白樣無(wú)信號(hào)，而Hc-PM膜呈現(xiàn)出典型的氮氧自由基的三重峰，證明了1O2的存在。說(shuō)明竹紅菌素的負(fù)載使得Hc-PM膜經(jīng)光照后能將O2轉(zhuǎn)化為1O2，發(fā)揮其光敏效能。

2.5 氧化性能分析

竹紅菌素經(jīng)光照后產(chǎn)生1O2，利用1O2對(duì)I-的氧化作用進(jìn)行氧化性能分析[23]。圖6示出Hc質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的Hc-PM納米纖維膜在持續(xù)光照條件下，溶液紫外吸收變化的光譜圖。可知，在1O2的氧化作用下，I-被氧化為I3-，且I3-的濃度正比于1O2的濃度[24]。隨著I3-的濃度上升，溶液呈淡黃色，在紫外光譜的287和351 nm處出現(xiàn)其特征峰，后文選取351 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖6 Hc-PM納米纖維膜的KI溶液紫外吸收光譜Fig.6 UV-Vis absorption spectra of KI solution photooxidized by Hc-PM nanofibrous membrane

圖7為PM和Hc質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的Hc-PM膜隨光照時(shí)長(zhǎng)的增加，在351 nm處吸光度的變化圖?？芍篜M膜經(jīng)可見(jiàn)光照射后，吸收值有較小上升趨勢(shì)，說(shuō)明PM膜和KI在空氣中能發(fā)生少量的氧化反應(yīng)；而添加了竹紅菌素的Hc-PM膜經(jīng)光照后，351 nm處吸收值顯著增加，說(shuō)明其具有良好的光動(dòng)力氧化性能。

圖7 PM和Hc-PM膜在351 nm處的KI溶液紫外吸收?qǐng)DFig.7 UV-Vis absorbance of KI solution at 351 nm photooxidized by PM and Hc-PM nanofibrous membranes

為進(jìn)一步證明竹紅菌素的添加賦予了PM膜氧化能力，檢測(cè)竹紅菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%和0.3%的Hc-PM膜底物的氧化能力，結(jié)果如圖8所示?？芍S著竹紅菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，Hc-PM納米纖維膜的氧化能力有所提高。

2.6 光動(dòng)力抗菌性能分析

表2示出PM和竹紅菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的Hc-PM膜對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率測(cè)試結(jié)果。可知，PM膜無(wú)論是在光照條件，還是暗室條件下，對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸桿菌均無(wú)明顯抗菌效果。Hc-PM膜在光照條件下，對(duì)金黃色葡萄球菌具有良好的抗菌效果，抑菌率約為99.97%；但對(duì)大腸桿菌的抗菌效果不佳，抑菌率約為54.41%。主要原因有2個(gè)：一是竹紅菌素本身對(duì)革蘭氏陰性菌不敏感[6]；二是革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌的結(jié)構(gòu)不同，屬于革蘭氏陽(yáng)性菌的金黃色葡萄球菌外膜成分主要為肽聚糖，其疏松多孔的結(jié)構(gòu)易被光敏劑分子及活性氧物質(zhì)穿透，而屬于革蘭氏陰性菌的大腸桿菌的外膜在肽聚糖的基礎(chǔ)上，還有脂多糖、脂質(zhì)雙層和脂蛋白，結(jié)構(gòu)較為密實(shí)，因而能有效阻止一部分光敏劑分子及活性氧物質(zhì)穿透其結(jié)構(gòu)并對(duì)其產(chǎn)生光敏抗菌效果[25]，因此，Hc-PM膜對(duì)大腸桿菌的抗菌效果不如金黃色葡萄球菌。

表2 PM和Hc-PM膜對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的抗菌效果Tab.2 Antibacterial effect of S. aureus and E. coli using PM and Hc-PM nanofibrous membranes

3 結(jié) 論

1)通過(guò)靜電紡絲法成功制備了含竹紅菌素的聚(甲基丙烯酸甲酯-co-甲基丙烯酸)(P(MMA-co-MAA))納米纖維膜，竹紅菌素被較好地負(fù)載于納米纖維基材上。竹紅菌素的加入使納米纖維膜的橫截面由圓形變得不規(guī)則，纖維粗細(xì)不勻度提高，疏水性增加，其熱力學(xué)性能降低較小。

2)含竹紅菌素的P(MMA-co-MAA)納米纖維膜在光照條件下可生成1O2，具有光動(dòng)力氧化性能，且在一定范圍內(nèi)，竹紅菌素質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，其在可見(jiàn)光條件下的底物氧化能力越強(qiáng)。另外，該納米纖維膜對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌效果(抑菌率約為99.97%)，但對(duì)大腸桿菌的抗菌效果不佳。