陳春營，韓麗娟

(1.右江民族醫(yī)學院研究生學院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔科，廣西 百色 533000)

0 引言

齲齒和牙周病被認為是人類最普遍的細菌感染疾病，這類口腔病變的主要病因是口腔表面病原微生物的定植，即生物膜的形成。生物膜是指微生物粘附于生命或非生命的介質(zhì)表面，并被其自身分泌的胞外基質(zhì)包裹而形成的一種穩(wěn)定復雜的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[1]。與浮游細菌相比，獲得了對傳統(tǒng)抗生素和宿主免疫反應高度耐受的特性，用抗生素治療很難將其徹底殺滅或者清除，且加大抗生素的用量不僅對生物膜內(nèi)的細菌無效，還可能引起無法預知的毒副作用[2]。因此，近年來，對抑制浮游微生物生長和/或浮游微生物發(fā)展成生物膜的新分子的研究一直在加強。在此背景下，抗菌肽(antimicrobial peptides, Amps)已成為口腔微生物學領(lǐng)域的研究熱點。AMPs是由無脊椎動物、植物和動物的各種組織和細胞系產(chǎn)生的一組異構(gòu)分子。作為多細胞生物固有免疫反應的組成部分，對細菌、真菌、原生動物、病毒具有廣泛的抗菌活性，對癌細胞具有細胞毒活性。這些分子由于其濃度低、選擇性抗菌活性低以及微生物耐藥性誘導率低，已被證明是控制微生物生長的有前途的藥劑。

本文首先簡要介紹了AMPs分類特點，然后系統(tǒng)闡述了AMPs的抗菌機制和人工合成物的最新進展和臨床應用，并展望了該領(lǐng)域的發(fā)展前景。

1 AMPs的基本結(jié)構(gòu)

AMPs是一種天然抗菌分子，它從原核生物(如細菌)和真核生物(如原生動物、真菌、植物、昆蟲和動物)中分離出來，被認為是生物體內(nèi)天然防御的多功能效應器。在人體中抗菌肽可以在很多組織中表達，包括皮膚上皮細胞、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)甚至是免疫系統(tǒng)中。AMPs通常是10到50個氨基酸殘基組成，由于賴氨酸和精氨酸殘基的豐富，它們具有正的電荷范圍從+2到+9，這對與負電荷的靜電相互作用至關(guān)重要。由于二硫鍵橋的存在或與膜的接觸，它們采用三維兩親結(jié)構(gòu)[3]，帶正電的親水結(jié)構(gòu)域與疏水結(jié)構(gòu)域能很好地分離，這種組合非常適合與膜相互作用，特別是細菌膜與其帶負電荷的親水基團和疏水核心。由于陽離子氨基酸殘基在許多抗菌肽中含量豐富，因此常也稱為陽離子宿主防御肽或陽離子抗菌肽。

2 AMPs的分類和作用機制

2.1 AMPs的分類

AMPs根據(jù)來源可分為昆蟲、其他動物、合成微生物和基因工程微生物。根據(jù)二級結(jié)構(gòu)分為α-螺旋肽、β-薄片肽、擴展肽和環(huán)肽四類。大多數(shù)AMPs屬于前兩類。其中，α-螺旋肽是目前研究最多的AMPs。α-螺旋型和β-薄片型AMPs是通過破壞細菌膜發(fā)揮抗菌活性。β鏈型聚脯氨酸或環(huán)狀螺旋，如Nisin和PR-39，在蛋白質(zhì)水解方面較穩(wěn)定[4]。許多擴張型AMPs對病原體的細胞膜沒有活性，它們是通過穿透細胞膜和與細胞內(nèi)靶標相互作用來實現(xiàn)抗菌活性。

2.2 AMPs的抗菌機制

無論細胞的代謝階段如何，膜的完整性對于細菌的生存都是至關(guān)重要的。大多數(shù)AMPs以微生物的膜完整性為目標，通過裂解導致細胞死亡。AMPs的典型特征是與膜相互作用的能力，其特點是膜滲透。這些多肽被顯著的親水帶正電荷的結(jié)構(gòu)域促進，與帶負電荷的微生物表面相互作用，以及雙分子層磷脂的頭部基團導致細胞膜穿透。因此，跨膜電位和pH梯度被破壞，滲透調(diào)節(jié)受到影響。傳統(tǒng)陽離子AMPs通過靜電作用與革蘭氏陰性菌外膜結(jié)合，并通過“桶壁”“環(huán)孔”或“地毯”孔機制通過膜的不穩(wěn)定穿過革蘭氏陰性菌外膜，破壞細胞質(zhì)膜的物理完整性。還有觀點認為AMPs抑制大分子合成(蛋白質(zhì)、DNA和RNA)或靶向代謝酶[5]來殺死細胞。目前，AMPs的作用機制尚不完全清楚。然而，一些關(guān)于這些分子如何作用于細胞膜和細菌代謝的理論已經(jīng)被提出，以氨基酸的理化特性和分子機制為基礎(chǔ)[6]的抗菌機制主要包括以下4種：(1)桶壁模型：肽足夠長，可以垂直穿透膜，并在脂質(zhì)雙分子層上形成一個桶形孔，允許細胞內(nèi)的物質(zhì)流出到細胞外環(huán)境。(2)地毯模型：在這個模型中，AMPs以一種類似洗滌劑的方式作用，覆蓋細胞表面，直到達到閾值濃度，導致膜斑塊的形成，其中脂類形成由兩親肽穩(wěn)定的環(huán)狀聚集物。因此，細胞膜發(fā)生劇烈破壞，導致細胞死亡[7]。(3)環(huán)孔模型：肽與膜的初始結(jié)合之后是進入的單體單元的級聯(lián)聚集，導致外膜和內(nèi)膜的脂質(zhì)部分向內(nèi)折疊，形成一個由多個肽單元排列的連續(xù)通道[8]，允許流體外流到外部環(huán)境。(4)細胞內(nèi)靶向機制：除了與細胞膜相互作用的能力外，越來越多的證據(jù)表明AMPs具有其他的細胞內(nèi)靶點。它們可以有多個細胞內(nèi)目標——它們可以結(jié)合DNA、RNA和蛋白質(zhì)，抑制細胞壁合成，以及DNA、RNA或蛋白質(zhì)合成。此外，在體外或體內(nèi)，多肽可通過幾種類型的AMPs引起的細胞成絲而干擾細菌的胞質(zhì)分裂。它們有獨特的轉(zhuǎn)運機制，以改變細胞質(zhì)膜隔膜[7]的形成，抑制細胞壁合成，抑制核酸合成，抑制蛋白質(zhì)合成或抑制酶活性，如Drosocin, pyrrhocoricin和apidecin等。雖然膜損傷模型不同，但它們大多是相互關(guān)聯(lián)的。這種復雜的、通常是多模態(tài)的抗菌作用使微生物更難形成持久的耐藥機制，這提供了抗菌肽相對于傳統(tǒng)抗生素的另一個顯著優(yōu)勢。

3 AMPs及其合成產(chǎn)物的臨床應用

由于生產(chǎn)成本高，AMPs作為原料藥的發(fā)展受到很大限制。多肽的化學合成雖然效率高，但也非常復雜和昂貴。因此，越來越多的具有各種性質(zhì)的新型AMPs通過基因工程正在被發(fā)現(xiàn)或合成。

3.1 治療創(chuàng)口感染

大多數(shù)抗菌肽具有顯著的殺菌功能，用于炎癥和免疫細胞的募集、激活、成熟和組織修復。皮膚和軟組織感染是人類最常見的微生物感染之一，AMPs由于其對多種微生物具有殺菌活性(包括白色念珠菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌)，滲透血液的能力較低，在局部給藥的靶部位具有高濃度的優(yōu)勢。Zhu等[9]以乙二醇殼聚糖和醛改性聚乙二醇為基礎(chǔ)制備了一種含粘菌素的水凝膠，利用體內(nèi)小鼠燒傷感染模型實驗證明，釋放的粘菌素成功治愈了粘菌素敏感和耐藥銅綠假單胞菌引起的慢性傷口感染。hBD2是由表皮生長因子受體激活誘導的，它可以增加角質(zhì)形成細胞的遷移和細胞因子的產(chǎn)生[10]。LL-37肽在創(chuàng)傷后表達也增加[11]，有促炎和抗炎活性，能促進趨化、血管生成。由于皮膚，口腔微生物群不僅包括細菌種類，還包括病毒、真菌，與傳統(tǒng)抗生素相比，這種廣譜抗菌肽抗炎效果更好。在創(chuàng)面，AMPs不僅可以防止病原菌在創(chuàng)面皮膚中的增殖和生物膜的形成，還可以通過調(diào)節(jié)細胞遷移、趨化、細胞因子釋放和血管生成來促進創(chuàng)面愈合[12]。因此，AMPs在治療牙齦炎、牙周炎、鵝口瘡、皮膚感染性和非感染性傷口方面有較大潛力。

3.2 防齲和治療牙周炎

AMPs能有效地破壞早期牙菌斑生物膜的形成，在齲病防治領(lǐng)域可提供新的思路。劉奕[13]等發(fā)現(xiàn)十肽對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、普通變形桿菌等都有較強的抑菌殺菌作用，且當十肽的濃度增加到1 g·L-1的高濃度時也不會導致人牙齦成纖維細胞死亡，仍能使細胞膜保持較完整的結(jié)構(gòu)。何佳寧[14]等發(fā)現(xiàn)經(jīng)KR-1、KR-2處理后的變異鏈球菌生物膜變得不完整和疏松，有利于后續(xù)的機械清除。GH12和ZXR-2不僅可抑制口腔鏈球菌的活性，還可抑制細菌致齲性以及改變多種生物膜組成[15]；TVH19不僅有抗菌的作用，還兼具有促進再礦化的能力[16]；Nal-P-113[17]對口腔病原體及其生物膜具有良好的清除能力，可以抑制和殺死浮游狀態(tài)的牙周病優(yōu)勢菌(如牙齦卟啉單胞菌，伴放線聚集桿菌)抗菌作用比青霉素和甲硝唑更快、更強。

人工合成的AMPs在有效濃度內(nèi)具有較好的生物相容性，抗生物膜特性，對多種口腔致病菌具有快速、高效的抑制及殺滅作用；由此研究結(jié)果推測，通過口內(nèi)局部用藥，短時間的藥物接觸后能持續(xù)抑制口腔變異鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌等致病菌生長，維持口腔菌群平衡，達到防齲和治療牙周炎目的。

3.3 抗腫瘤作用

雖然AMPs的研究主要集中在抗菌特性上，但越來越多的證據(jù)表明，AMPs具有抗腫瘤功能。目前已經(jīng)提出了三種機制，即：(1)細胞膜的溶解；(2)外部凋亡途徑的激活；(3)抑制血管生成。有些AMPs特異性靶向腫瘤或癌細胞，通過轉(zhuǎn)化細胞破壞正常哺乳動物細胞膜的不對稱性[18]，這種不對稱性的變化通常是凋亡細胞和幾種類型的癌細胞所共有的，有利于單核細胞識別和清除這些細胞。此外，AMPs還能夠內(nèi)化細胞，與線粒體等細胞內(nèi)隔間相互作用，誘導細胞凋亡[19]。TX-315溶瘤特性不僅殺死癌細胞，也改變腫瘤微環(huán)境，減少免疫抑制腫瘤和髓系抑制細胞和多功能增加頻率T輔助型細胞毒性[20]。nisin能在體外抑制頭頸部鱗狀細胞癌的生長，誘導細胞凋亡和細胞周期抑制，同時降低細胞增殖[21]。LL-37在不同細胞和組織中的失調(diào)[22]似乎有助于促進癌癥和增加腫瘤發(fā)生。迄今為止，人類合成的抗菌肽α-和β-防御素是研究最多的防御素。α-防御素的抗腫瘤活性，特別是人類中性粒細胞肽的抗腫瘤活性，已經(jīng)通過膜溶解和凋亡機制以及抑制腫瘤生長所需的新生血管得到證實。然而，與大多數(shù)抗癌藥物一樣，AMPs也會殺死正常細胞，如成纖維細胞、上皮細胞和白細胞，對腫瘤細胞也缺乏選擇性。

AMPs的抗癌特性可以阻斷病毒的附著和進入，在宿主細胞內(nèi)的生長和復制，引起多細胞生物的程序性細胞死亡。AMPs有潛力成為唯一一類可用于治療多重微生物聯(lián)合感染和癌癥的藥物，但是目前許多AMPs的抗癌機制尚不清楚，AMPs的抗腫瘤活性和抗腫瘤特異性的限制仍需通過肽工程的重組表達去解決。

4 安全性評價

一些研究報道了抗菌肽與其他常規(guī)或非常規(guī)藥物聯(lián)合使用的潛力。這種協(xié)同組合可以幫助提高效力，同時減少治療劑量、副作用和耐藥性的威脅。如鏈霉素、復方新諾明聯(lián)合CM11肽對馬利斯特布魯氏菌耐藥菌株有協(xié)同作用[23]。安全性方面，許多體內(nèi)研究表明，在低APMs的實驗室小鼠中幾乎沒有毒性。但是，當AMPs因作為耐藥微生物引起的感染的替代或補充治療的潛力開發(fā)用于臨床目的時，因生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)過程復雜、酶降解的不穩(wěn)定性、可能與血清蛋白相互作用而導致循環(huán)半衰期縮短[9]，以及不可預測的毒性，使APMs的治療應用仍然受到限制。廣泛的結(jié)構(gòu)-功能研究是必要的，以確定最佳抗菌膜效果所需的最小結(jié)構(gòu)特征，也還需要反復進行動物模型實驗，確定其的最佳給藥劑型、給藥途徑和給藥劑量。

5 研究展望

隨著抗生素耐藥菌株的產(chǎn)生和抗生素日益高昂的費用使得研發(fā)新型抗生素迫在眉睫，目前，抗菌肽是抗微生物耐藥最具前景的方法之一。這一點在越來越多的涉及這些肽的研究中得到了證實。APMs外用凝膠、水凝膠、外用乳膏、手術(shù)部位給藥的透明質(zhì)酸基水凝膠、口服液和漱口水等已應用于臨床。隨著技術(shù)的發(fā)展，更多的APMs可能在不久的將來進入臨床試驗，如用于種植體表面的抗菌肽涂層、改善皮膚狀態(tài)的化妝品、防齲的抗菌肽凝膠、開發(fā)成人類或其他動物的疫苗、醫(yī)療設(shè)備消毒劑和食品防腐劑等。雖然天然或合成的APMs尚未取代市場上最有效的抗生素，但在APMs研究領(lǐng)域已經(jīng)取得了顯著進展，尤其是在鑒定新肽序列、評估其抗感染的潛力方面[25]?？偟膩碚f，隨著尋求解決方案，改善APMs設(shè)計和肽生產(chǎn)技術(shù)的新進展，APMs將開啟其發(fā)展的新時代。