王艷琴

(江西省中西醫(yī)結合醫(yī)院，江西 南昌 330003)

據(jù)統(tǒng)計[1]，肝癌是我國第二位的惡性腫瘤，每年的死亡人數(shù)超過10萬，占世界肝癌死亡人數(shù)的40%左右。因此，對于肝癌的靶向性遞藥研究顯得尤為重要。藥物遞釋系統(tǒng)到達腫瘤部位后，仍然面臨如何滲透入腫瘤內部、如何提高藥物在腫瘤核心區(qū)域分布的問題。因此，構建能夠靶向肝癌細胞，且具有高腫瘤穿透能力的靶向遞藥系統(tǒng)具有十分重要的意義。研究表明[2-3]，不同粒徑的納米粒對實體瘤的穿透能力和滯留能力有顯著區(qū)別。小粒徑(如粒徑20 nm)納米粒的穿透能力遠遠大于大粒徑納米粒(如粒徑200 nm)，然而小粒徑納米粒在腫瘤部位的滯留能力卻遜于大粒徑納米粒。為克服這一缺陷，本研究構建了可收縮納米粒——修飾四氧化三鐵納米粒的凝膠納米粒(Gel)。該納米粒粒徑為150 nm左右，在腫瘤部位具有較好的滯留能力。滯留于腫瘤后由于腫瘤部位酶的作用，使凝膠降解而釋放出僅有10 nm的四氧化三鐵納米粒，從而有望具有更好的滲透性[4-6]。然而該策略僅有體外研究，尚無用于腫瘤靶向治療的研究報道。本文擬采用此策略構建具有腫瘤微環(huán)境響應性的可收縮肝癌靶向遞藥系統(tǒng)，以期在具有良好腫瘤靶向性的同時，進一步提高遞藥系統(tǒng)對腫瘤的穿透性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

ZNCL-T1000集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(西安予輝儀器有限公司)，DZF6050真空干燥箱(溫州鼎力醫(yī)療器械有限公司)，lx73倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 主要材料

Gel、樹枝狀高分子聚合物聚左旋賴氨酸(DGL)和紫杉醇(PTX)(購自中國科學院成都有機化學有限公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)和熒光探針香豆素-6(購自美國Sigma公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(購自北京索來寶有限公司)；DAPI(購自蘇州宇恒生物科技有限公司)。

1.3 載體材料的合成

精密稱取凝膠納米粒-探酰氯(Gel-COCl)100 mg和DGL-a-Co(OH) 1.5 g于250 mL燒瓶中，甲苯-四氫呋喃(3∶1)20 mL作為反應溶劑，三乙胺2 mL作為催化劑，在80 ℃條件下連續(xù)回流48 h(氮氣保護)，得到的反應溶液趁熱減壓濾過并用四氫呋喃和蒸餾水反復清洗，得到的黑色固體置于60 ℃干燥箱中干燥24 h，至產物得到恒定質量，產量約為55.44%。紫外可見吸收光滑法測試合成表征藥物載體材料的發(fā)光性能。

1.4 載PTX復合物的制備

精密稱取DGL-Gel 4 mg，加入PTX無水乙醇溶液0.5 mL，邊超聲邊滴加超純水3 mL，探頭超聲(功率400 W，工作3 s，間隔6 s，超聲10次)，4 000 r/min離心15 min，棄上清，取沉淀，加入質量濃度為10 mg/mL的泊洛沙姆188溶液5 mL，在探頭超聲條件下再經(jīng)4 000 r/min離心15 min，取上清，冷凍干燥得到PTX-DGL-Gel。采用色譜分析技術證實DGL-Gel對PTX的測定無干擾。

1.5 體外溶血試驗

實驗結果發(fā)現(xiàn)，陰性對照管上層液體為無色透明，無溶血發(fā)生；陽性對照管呈澄明紅色則發(fā)生了全溶血。PTX-DGL-Gel質量濃度為0.8 mg/mL時，溶血率為4.9%，溶血率隨著質量濃度的上升而增大，當質量濃度達到4 mg/mL時，溶血率為68.7%。

1.6 生物相容性評價

將hepG2細胞1×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，分別加入終質量濃度為5，10，15，20，25 mg/mL的PTX-DGL和PTX-DGL-Gel材料各200 μL，對照組加入等體積含血清培養(yǎng)基，每組設6 個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，避光加入10 μg/mL的MTT 150 μL，37 ℃孵育4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 100 μL，用酶標儀檢測490 nm波長處吸光度，計算細胞存活率。

1.7 細胞生長抑制率

調整hepG2細胞1×104/mL加入96孔培養(yǎng)板，分別加入PTX-DGL和PTX-DGL-Gel的質量濃度為0.005，0.010，0.050，0.100和0.500 μg/mL，同樣MTT方法檢測細胞生長抑制率。

1.8 細胞攝取試驗

首先，構建Zn(z)-Cys(6)(簡稱C6)標記載體，制備C6-PTX-DGL和C6-PTX-DGL-Gel材料，熒光分光光度法測定C6載藥量為21.46%。然后將hepG2細胞1×104/孔接種于6 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液漂洗，加入2 mL無血清培養(yǎng)液稀釋的游離C6溶液、C6-PTX-DGL和C6-PTX-DGL-Gel，使香豆素的終質量濃度為50 ng/mL；繼續(xù)孵育4 h，吸棄含藥培養(yǎng)液，用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3 次，4%多聚甲醛37 ℃固定20 min，DAPI染色15 min，冷PBS洗3次，防熒光淬滅封片劑封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察分析。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 生物相容性分析

hepG2細胞對PTX-DGL和PTX-DGL-Gel均有較好的生物相容性，細胞存活率隨著質量濃度的增加而逐漸下降，同濃度下，PTX-DGL-Gel對細胞的存活率顯著高于PTX-DGL，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖1)。

圖1 MTT法檢測細胞存活率

2.2 細胞生長抑制率

隨著PTX-DGL和PTX-DGL-Gel的質量濃度增加，細胞抑制率也逐漸升高，同濃度比較，PTX-DGL-Gel對細胞的抑制率明顯大于PTX-DGL，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖2)。

圖2 MTT法檢測細胞生長抑制率

2.3 細胞攝取率

培養(yǎng)48 h可見hepG2細胞對PTX-DGL-Gel的攝取率顯著高于PTX-DGL，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖3)。

3 討 論

癌癥是人類的第一殺手，目前對癌癥最常用的內科治療方法仍以化療為主，化學藥物在殺死腫瘤細胞的同時，也對正常的組織細胞產生很大的毒副作用，直接影響了患者的生理功能[7]。靶向給藥系統(tǒng)可以使藥物選擇性地濃集于病變器官、組織或者細胞中，提高化療藥物的治療效果，降低化療的系統(tǒng)毒性，是抗癌藥物新型制劑研究的方向[8]。目前用于靶向肝癌的用藥途徑主要有：第一，被動靶向[9-10]。利用癌癥的病理和生理特點，透過肝組織中的Kupffer細胞攝取遞藥微粒而達到被動靶向的作用。第二，主動靶向。利用肝癌細胞中高表達的受體，如轉鐵蛋白受體[11]、低密度脂蛋白受體[12]等，通過與之相對應的配體修飾遞藥系統(tǒng)，利用配體受體之間的親和力，達到主動靶向的作用。此外，樹枝狀高分子聚合物DGL具有易于修飾、載藥能力高、生物可降解等優(yōu)點[13]。DGL表面富含氨基，能夠方便用于修飾藥物和靶向分子，且其粒徑僅有5 nm，有望具有良好的穿透性[14]。因此本研究擬采用DGL作為載體。PTX是臨床一線抗腫瘤藥物，但其有毒副作用大、腫瘤靶向性差的缺點[15]，因此本研究選擇PTX作為模型藥物，將其修飾于DGL表面，形成藥物載體PTX-DGL。將藥物載體用明膠納米粒包裹而形成較大粒徑(約200 nm)的納米粒PTX-DGL-Gel，從而賦予該載體系統(tǒng)良好的腫瘤滯留能力和具有腫瘤微環(huán)境響應性的穿透能力[16]。抗生物素蛋白(Avidin)相對分子質量約為66 KDa，為高度糖基化的蛋白，含有很多堿性氨基酸，如賴氨酸和精氨酸，在通常情況下帶正電荷，Avidin的N端含乙酰半乳糖氨和甘露糖殘基，可以選擇性地聚集于肝臟部位[17]，還可以靶向肝癌細胞[18]。研究表明[19]，腹腔注射Avidin，可以選擇性地濃集于肝臟組織。本研究中，選擇Avidin作為靶向頭基修飾遞藥系統(tǒng)，實現(xiàn)肝癌的靶向給藥。該研究采用化學偶聯(lián)法合成PTX-DGL和PTX-DGL-Gel，紫外可見吸收光譜法對合成載體材料進行表征。色譜分析技術證實，DGL-Gel對PTX的測定無干擾。體外溶血試驗說明，在質量濃度為5，10，15，20，25 mg/mL時，hepG2細胞對PTX-DGL和PTX-DGL-Gel均有較好的生物相容性，隨著PTX-DGL和PTX-DGL-Gel的質量濃度增加，細胞抑制率逐漸升高，同濃度比較，PTX-DGL-Gel對細胞的抑制率明顯大于PTX-DGL(P<0.05)。提示，PTX-DGL-Gel對腫瘤細胞的靶向殺傷作用明顯提高。培養(yǎng)48 h可見hepG2細胞對PTX-DGL-Gel的攝取率顯著高于PTX-DGL(P<0.05)。提示，細胞對PTX-DGL-Gel的靶向攝取效率明顯提高，體現(xiàn)了可控納米遞藥系統(tǒng)對腫瘤細胞殺傷作用的主要特性[20]。

圖3 熒光標記細胞藥物的攝取率

綜上所述，可控納米遞藥系統(tǒng)PTX-DGL-Gel與肝癌細胞hepG2有較好的生物相容性，對細胞抑制率和攝取率明顯提高，增強了藥物的靶向療效。本研究根據(jù)肝癌的生理特點，利用腫瘤部位微環(huán)境，設計了能夠同時選擇性靶向肝癌細胞且具有良好腫瘤穿透性的可收縮納米遞藥系統(tǒng)PTX-DGL-Gel。該策略為肝癌的靶向診斷和治療提供了新思路，有望進一步提高對肝癌的治療效果，具有重要的研究價值和潛在的應用意義。