鐘凱樂, 宋小含, 段德麟, 胡自民

中國黃渤海真江蘺(Agarophyton vermiculophyllum)群體遺傳多樣性研究

鐘凱樂1, 2, 3, 宋小含1, 2, 3, 段德麟1, 2, 胡自民1, 2

(1. 中國科學院海洋研究所 海洋大科學研究中心 實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 青島 海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋生物學與生物技術功能實驗室, 山東 青島 266237; 3. 中國科學院大學, 北京 100049)

真江蘺是原產于西北太平洋的重要經濟紅藻。我們利用10對微衛(wèi)星引物檢測中國黃渤海地區(qū)真江蘺的群體遺傳多樣性和結構。10個微衛(wèi)星位點在12個群體中共檢測到65個等位基因, 每個位點的等位基因(a)為1~28, 有效等位基因(e)為1.0~9.6。每個群體的平均等位基因(a)、平均有效等位基因(e)、平均香濃指數(shù)()、平均觀察雜合度(o)和平均預期雜合度(e)分別為2.4、1.6、0.419、0.133和0.227, 顯示較低的群體遺傳多樣性。中國黃渤海12個真江蘺群體間遺傳分化較大(st=0.398 7), 基因流有限(m=0.377 1), 近交系數(shù)為正(is=0.391 3,it=0.634 0), 表明可能存在近交和雜合子缺失現(xiàn)象。Structure和UPGMA系統(tǒng)進化分析一致將12個群體分為兩個遺傳組, 并在黑石礁群體(HS)和石島群體(SD)中發(fā)現(xiàn)明顯的遺傳混雜現(xiàn)象。AMOVA分析顯示遺傳變異主要來自于群體內(73.27%)。該研究可為黃渤海地區(qū)真江蘺自然資源保護和管理提供科學依據(jù)。

真江蘺(); 微衛(wèi)星; 遺傳多樣性; 基因流; 黃渤海

氣候變化和近岸環(huán)境變遷是影響潮間帶海洋生物群體遺傳多樣性和分化的重要因素。黃渤海作為太平洋西部的邊緣海, 形成于第四紀更新世晚期[1], 在末次盛冰期(Last Glacial Maximum, LGM)經歷了劇烈的氣候和海岸環(huán)境變遷。更新世冰期導致全球海平面下降120~140 m[2], 使得西北太平洋邊緣海面積縮小, 黃渤海陸架幾乎完全暴露成為陸地, 東海向東縮減變?yōu)楠M長的沖繩海槽[2-3]。邊緣海面積的縮減導致海洋物種大量減少, 殘遺物種只能在避難所生存, 因此避難所的不連續(xù)性成為不同群體之間隔離和分化的重要因素[4], 其中沖繩海槽被證實是多種海洋生物的冰期避難所[3, 5]。在更新世間冰期, 氣溫回暖海平面上升, 殘遺物種從避難所擴展到新的棲息地。這種群體擴張可能導致來自不同避難所的群體之間的遺傳交換, 消除了隔離造成的群體分化[6]。除此之外, 黃渤海的洋流系統(tǒng)對海洋生物的遺傳多樣性和分化也具有重要影響[7]。主導黃渤海海域的洋流主要是北向的黑潮分支黃海暖流和南向的中國沿岸流, 黃海暖流和中國沿岸流驅動的群體遺傳均質性在鼠尾藻()[7-8]和角叉菜()[5]等多種海洋生物中已有報道。

真江蘺()隸屬于紅藻門(Rhodophyta), 真紅藻綱(Florideophyceae), 江蘺目(Gracilariales), 江蘺科(Gracilariaceae),屬, 是原產于亞洲-西北太平洋的一種食用紅藻, 也是一種在世界范圍內廣泛分布的入侵種[9]。真江蘺不僅是提取瓊膠的主要原料, 而且是重要的生態(tài)奠基物種, 因此具有重要的經濟和生態(tài)價值[10-11]。除此之外, 真江蘺還可作為生物過濾器凈化水質, 在海水富營養(yǎng)化修復和多營養(yǎng)層次綜合水產養(yǎng)殖系(Integrated Multi-Trophic Aquaculture, IMTA)中都具有廣泛應用[12-13]。

目前, 相對于真江蘺的入侵, 對該物種的群體遺傳學研究仍然較少, 且大多基于單一的線粒體分子標記。Krueger-Hadfield等[9]基于線粒體1 (~1 200 bp)檢測到黃渤海地區(qū)真江蘺群體為一個單一遺傳譜系, 但該研究主要涉及朝鮮半島西海岸群體, 中國沿海采樣點極少。劉若愚等[14]基于1(641 bp)在中國黃渤海沿岸真江蘺群體中檢測到10個單倍型, 為一個共同的遺傳譜系, 群體間遺傳分化較弱[14]。Hu等[15]基于AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)發(fā)現(xiàn)黃渤海地區(qū)真江蘺群體為共同的遺傳譜系, 并且在青島地區(qū)群體中發(fā)現(xiàn)小尺度的遺傳分化。

微衛(wèi)星具有遺傳信息豐富、多態(tài)性高、中性選擇、共顯性遺傳等特點, 重復性好、易于檢測、穩(wěn)定性高, 在海藻群體遺傳多樣性研究中具有廣泛應用[16-17]。本研究共收集中國黃渤海12個群體的196株真江蘺樣品, 利用微衛(wèi)星數(shù)據(jù)旨在深入分析該地區(qū)真江蘺的群體多樣性特征, 同時檢測是否在小地理尺度存在遺傳結構和遺傳變異的時空分布模式。該研究有助于理解氣候變化與當代環(huán)境的相互作用對海藻遺傳變異的影響, 從而為真江蘺自然資源保護和管理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 真江蘺樣本采集

我們采集到來自遼東半島和山東半島潮間帶12個地點的真江蘺樣本(表1)。在每個采樣點, 隨機采集6~20個真江蘺個體, 確保個體之間距離大于10 m以最大程度避免采集到遺傳一致的個體。樣品清洗干凈后置于硅膠中干燥保存。

表1 黃渤海真江蘺樣本采集信息

1.2 DNA提取與檢測

取30 mg真江蘺樣本, 在液氮中冷凍并研磨成粉末, 使用諾貝萊一步法多糖多酚植物基因組DNA抽提試劑盒DNE379(Nobelab)提取DNA, 具體操作見說明書。1%瓊脂糖凝膠電泳(140 V, 30 min)檢測DNA質量。

1.3 PCR擴增和電泳檢測

我們使用Kollars等[18]和Krueger-Hadfield等[19]開發(fā)的10對真江蘺微衛(wèi)星引物進行片段擴增(表2), 引物由北京擎科生物科技有限公司青島分公司合成。本實驗我們采用雙重熒光檢測, F正向引物的5′端連接熒光基團(FAM或HEX)。PCR擴增反應體系15 μL: 模板DNA 1.0 μL(約15 ng), 2*Tsingke Master mix 7.5 μL, 正向引物和反向引物各1.0 μL(10 μmol/L),滅菌水4.5 μL。PCR反應程序: 98℃預變性2 min; 98℃變性10 s, 56℃退火10 s, 72℃延伸10 s, 30個循環(huán); 最終72℃延伸5 min。PCR擴增產物在3730型遺傳分析儀(ABI, USA)上進行毛細管電泳檢測(北京擎科生物科技有限公司青島分公司)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用軟件Gene mapper v4.1讀取數(shù)據(jù)并匯總。Popgene v1.32[20]和GenAlex v6.501[21]計算各微衛(wèi)星位點和群體的遺傳參數(shù)。包括等位基因數(shù)(a), 有效等位基因數(shù)(e), 香濃指數(shù)(), 觀察雜合度(o), 預期雜合度(e), 哈迪-溫伯格平衡偏離指數(shù)(=o–e/e),統(tǒng)計量(is,it和st), 基因流(m),s遺傳距離和相似性。

用Poptree v2[22]構建基于遺傳距離D的UPGMA聚類樹, 設置自展值為(bootstrap)1 000。在Structure v2.3.4[23]中基于貝葉斯聚類法對群體遺傳結構進行分析。參數(shù)設置為: Length of Burnin period為105, Number of MCMC Reps after Burnin為106, K值設置為1~5, 每個K值重復運算10次?；贒elta K=mean(|L″(K)|)/ sd(L(K)), 在Structure Harvester中確定最佳K值, 即最佳分類群數(shù)。

在Arlequin v3.5.1.3[24]中進行分子方差分析(AMOVA), 基于104次重復抽樣檢測群體間和群體內的遺傳結構和遺傳變異的分布。

表2 真江蘺10個微衛(wèi)星位點的信息

2 結果

2.1 遺傳參數(shù)

10個微衛(wèi)星位點共檢測出65個等位基因, 每個微衛(wèi)星位點等位基因(a)為1~28, 有效等位基因(e)為1.000~9.614。其中Gverm 5276和Gverm 7969分別具有最高和最低的等位基因和有效等位基因數(shù)目(表2)。

每個群體在10個微衛(wèi)星位點的遺傳參數(shù)見表3。各群體的等位基因數(shù)(a)為1.4~3.5, 平均等位基因數(shù)為2.4; 有效等位基因數(shù)(e)為1.123~2.346, 平均有效等位基因數(shù)為1.644; 香濃指數(shù)()為0.120~ 0.649, 平均香濃指數(shù)為0.419; 觀測雜合度(o)和預期雜合度(e)分別為0.012~0.276和0.073~0.349, 平均觀測雜合度和預期雜合度分別為0.133和0.227, 各群體的觀測雜合度均低于預期雜合度。12個群體中哈迪-溫伯格偏離指數(shù)()均為負值, 表現(xiàn)為雜合子缺失。

2.2 群體遺傳結構

12個真江蘺群體的-統(tǒng)計量及基因流分析(表4) 顯示, 近交系數(shù)is為–0.506 4~0.855 8, 平均近交系數(shù)is為0.391 3, 其中Gverm 1803和Gverm 5276的近交系數(shù)為負值; 各位點的總群體近交系數(shù)it為–0.144 8~0.770 4, 平均值為0.634 0, Gverm 5276為負值; 度量群體間遺傳差異程度的st為0.000 0~ 0.730 6, 平均值為0.398 7, 遺傳分化程度較高; 基因流m為0.092 2~2.214 4, 平均值為0.377 1, 不同位點的基因流值變化較大。

表3 10個微衛(wèi)星位點在12個真江蘺群體的遺傳多樣性參數(shù)

12個真江蘺群體s遺傳相似性及遺傳距離見表5。各群體間遺傳相似性指數(shù)以銀海國際(YH)和三浴(SY)之間最大(0.987), 雞鳴島(JM)和銀海國際(YH)之間最小(0.497); 相應的,s遺傳距離以雞鳴島(JM)和銀海國際(YH)之間最大(0.699), 銀海國際(YH)和三浴(SY)之間最小(0.013)。

12個真江蘺群體的遺傳分化系數(shù)(st)和基因流(m)見表6。群體間最大的遺傳分化在長島(CD)和銀海國際(YH)之間(0.536), 最小在石老人(LR)和三浴(SY)之間(0.022)。最大基因流發(fā)生在三浴(SY)和石老人(LR)之間(11.166), 最小基因流發(fā)生在銀海國際(YH)和長島(CD)之間(0.216)。山東半島南側的群體之間遺傳分化較小, 基因交流頻繁。

表4 F-統(tǒng)計量和基因流

表5 12個真江蘺群體間的Nei’s遺傳相似性(上三角)和遺傳距離(下三角)

表6 12個真江蘺群體間的遺傳分化系數(shù)Fst(下三角)和基因流Nm(上三角)

續(xù)表

Structure分析顯示黃渤海12個真江蘺群體最佳遺傳聚類數(shù)K=2(圖1), 與UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹結構一致(圖2)。獐子島(ZZ)、長島(CD)和雞鳴島(JM)為一個遺傳組, 其他群體聚為第二個遺傳組, 其中黑石礁(HS)和石島(SD)具有明顯的遺傳混雜現(xiàn)象。AMOVA分析顯示群體間遺傳變異占36.73%, 群體內變異占 73.27%, 表明群體內遺傳變異是引起黃渤海真江蘺群體變異的主要因素(表7)。

3 討論

等位基因、有效等位基因、雜合度等是判斷群體遺傳多樣性的重要指標, 種群的遺傳多樣性越高其環(huán)境適應能力越強, 相應的進化潛力也越大。本研究中12個真江蘺群體的a(2.4),e(1.644),(0.419),o(0.133)和e(0.227)等遺傳參數(shù)較低, 與劉若愚等[14]利用1(d=0.300, π=0.050×10–2)和Hu等[15]利用AFLP(Na, 0.336~1.224; Ne, 1.057~1.142; I, 0.059~0.161)檢測的結果基本吻合, 一致表明中國黃渤海地區(qū)真江蘺群體遺傳多樣性和變異程度較低, 環(huán)境適應能力可能較差。is(0.391 3)、it(0.634 0)和哈迪-溫伯格平衡偏離指數(shù)(<0)表明該地區(qū)真江蘺群體普遍存在雜合子缺失現(xiàn)象。這些遺傳特征可能與真江蘺的繁殖方式和繁殖特點有關。在自然界, 相對于四分孢子體植株, 江蘺科海藻雌雄配子體植株數(shù)量較少[25-26]。真江蘺等紅藻進行有性繁殖時, 釋放的四分孢子和精子存活時間較短, 沒有鞭毛結構且不具自主游動能力, 只能隨著水流在近距離的雌配子果胞上完成受精[27], 這種有限距離的擴散降低了群體間遺傳交換, 導致群體遺傳多樣性偏低。此外, 真江蘺也可通過斷枝方式進行營養(yǎng)繁殖[28], 而營養(yǎng)繁殖的方式也大大降低了真江蘺的雜合度和群體遺傳多樣性。

圖1 基于10個微衛(wèi)星的12個真江蘺群體的遺傳結構圖(底圖審圖號: GS(2019)1711號)

圖2 基于Nei’s遺傳距離構建的12真江蘺群體的UPGMA聚類樹

注: 分支上的數(shù)字表示檢驗重復1 000 次所得的大于50%的支持率

表7 12個真江蘺群體的分子方差分析

通過群體間遺傳分化系數(shù)st、s遺傳距離和基因流m可知黃渤海地區(qū)真江蘺群體之間遺傳分化較大, 基因流有限。Krueger-Hadfield等[9]利用微衛(wèi)星在日本地區(qū)真江蘺群體間檢測到類似的較高的群體間遺傳分化模式, 并證實遺傳分化系數(shù)st與地理距離呈正相關。Hu等[15]利用AFLP也發(fā)現(xiàn)黃渤海真江蘺群體間較高的遺傳分化, 與本研究結果一致。除了真江蘺的繁殖特點外, 群體間棲息地的不連續(xù)性造成的地理隔離可能是另一個驅動因素[29]。真江蘺可適應多種棲息環(huán)境, 在河口和海岸潮間帶環(huán)境均有分布, 生境的不連續(xù)性和異質性(例如: 泥灘、沙灘、礁石和石礫)可能導致了群體水平的遺傳分化。此外, 這種小地理尺度的遺傳分化可能也與微地理環(huán)境差異有關[30], 例如鹽度與潮汐。黃渤海不同季節(jié)和地區(qū)鹽度變化較大[31], 而真江蘺可以適應5‰~ 60‰的鹽度變化[32]。已有報道顯示鹽度梯度可對等位基因頻率產生強選擇(例如,)[33], 對無融合生殖和表型變異產生影響并最終導致基因型分化(例如,)[34]。山東半島和遼東半島毗鄰黃海, 屬于溫帶季風氣候, 全年處于不規(guī)則半日潮中。高濱岸和低濱岸之間的潮汐強度也可能對真江蘺產生選擇壓力, 從而產生微地理尺度的遺傳分化。

通過Structure遺傳結構可知, 中國黃渤海12個真江蘺群體分化為2個遺傳組, 但是并沒有發(fā)現(xiàn)如Hu等[15]在青島地區(qū)檢測到的特有遺傳分化現(xiàn)象。Hu等[15]檢測到黃渤海真江蘺地理障礙發(fā)生在JM和ZZ群體間, 而本研究發(fā)現(xiàn)這種遺傳隔離發(fā)生在山東半島的東南部(JM和DC群體之間), 類似的現(xiàn)象在該地區(qū)并不常見。眾多研究表明, 由于更新世冰期海平面下降, 現(xiàn)今黃渤海地區(qū)的海洋生物大多起源于沖繩海槽避難所, 并在間冰期隨著黑潮、黃海暖流和中國沿岸流向黃渤海和東海地區(qū)擴張遷移, 故該地區(qū)的海洋生物大多屬于同一遺傳譜系, 具有較強的遺傳均質性[5, 7-8]。因此, 我們推測這種遺傳隔離可能與山東半島形成的地理屏障和真江蘺有限傳播能力共同造成的基因交流障礙有關。

劉若愚[35]檢測到真江蘺的基因流方向為遼東半島至山東半島至青島, 與該地區(qū)洋流運動相一致, 這可能是山東半島南部真江蘺群體(SD)出現(xiàn)北部基因型(遺傳組1)的重要原因。我們在遼東半島的群體中(HS和HN)發(fā)現(xiàn)山東半島南部群體的主要基因型(遺傳組2), 推測這種逆洋流方向的遺傳混雜可能與遼東半島和山東半島之間頻繁的海上航運等人為因素有關。雖然真江蘺的孢子和精子運動能力有限, 但作為一個世界范圍內的入侵種它可以附著在船體、纜繩、魚竿、蝦和蟹籠等硬基質上, 通過海上運輸、休閑漁業(yè)和水產養(yǎng)殖活動等傳播擴散[36]。

4 結論

本研究基于10對微衛(wèi)星引物對12個黃渤海真江蘺群體進行群體遺傳多樣性分析, 發(fā)現(xiàn)該地區(qū)真江蘺群體遺傳多樣性較低, 雜合子缺失, 并在山東半島東南部檢測到罕見的遺傳隔離。該研究對黃渤海海藻多樣性形成和自然資源保護提供了科學基礎。

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Population genetic diversity of the red alga(Gigartinales, Rhodophyta) in the Yellow-Bohai Sea

ZHONG Kai-le1, 2, 3, SONG Xiao-han1, 2, 3, DUAN De-lin1, 2, HU Zi-min1, 2

(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Center for Ocean Mega-Science, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

; microsatellite; genetic diversity; gene flow; Yellow-Bohai Sea

is one of the most economically important red algae native to the northwest Pacific. We surveyed the population genetic diversity and the structure ofin the Yellow-Bohai Seausing 10 microsatellites. These microsatellites detected 65 alleles among 12 populations. The number of alleles (a) varied from 1 to 28, and the number of effective alleles (e) varied from 1.0 to 9.6. The average number of alleles (a), the average number of effective alleles (e), the average Shannon’s diversity index (), the average observed heterozygosity (o), and the average expected heterozygosity (e) were 2.4, 1.6, 0.419, 0.133, and 0.227, respectively, indicating a low population genetic diversity. There was a high genetic differentiation among the 12populations (st= 0.398 7) and a limited gene flow (m= 0.377 1). The average inbreeding coefficient was positive (is= 0.391 3,it= 0.634 0), which indicates inbreeding and heterozygotic deletion. Structure analysis and UPGMA tree analysis consistently divided the 12 populations into two genetic groups, and obvious genetic mixing was found in the Heishijiao, Dalian and Shi Island, Weihai populations. Analysis of molecular variation showed that the genetic variation in the Yellow-Bohai Sea mainly occurred at the intra-population level (73.27%). This study may provide a scientific basis for the conservation of natural resources and management ofin the Yellow-Bohai Sea.

the National Natural Science Foundation of China, No. 41761144057, No. 31971395]

Mar. 28, 2020

Q347

A

1000-3096(2020)12-0023-09

10.11759/hykx20200328001

2020-03-28;

2020-04-20

國家自然科學基金項目(41761144057, 31971395)

鐘凱樂(1995-)，女，漢族，山東德州人，碩士，研究方向為海藻系統(tǒng)進化與多樣性，E-mail:18865550027@163.com；胡自民，通信作者，男，博士，研究員，研究方向為海藻系統(tǒng)進化與多樣性，E-mail: huzm@qdio.ac.cn.

(本文編輯: 楊 悅)