張強，張維維，丁勇，王佳雪，方春秋，齊偉辰*

1.長春中醫(yī)藥大學 藥學院，吉林 長春 130117；2.吉林省長白山中藥資源工程研究中心，吉林 長春 130117

龍膽GentianascabraBunge為龍膽科多年生草本植物，為我國常用藥用植物，其根及根莖入藥，有極其重要的經(jīng)濟價值和藥用價值。龍膽主產(chǎn)東北地區(qū)，春、秋二季均可采收，以秋采者質量最佳。龍膽含有多種化學成分且藥理活性顯著，能夠保肝、健胃、抗炎、抗菌、調節(jié)免疫力等[1]。《中華人民共和國藥典》2015年版記載中藥龍膽的基原植物包括龍膽、三花龍膽G.trifloraPall.、條葉龍膽G.manshuricaKitag.或者堅龍膽G.rigescensFranch.，前3種習稱為“龍膽”，后一種習稱為“堅龍膽”[2]。龍膽是近200種中成藥的重要原料[3]，如龍膽瀉肝湯等[4]。

DNA條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認的、相對較短的序列來進行物種鑒定的一種分子生物學技術。在藥用植物的物種鑒定領域，DNA條形碼鑒定技術最實際的用途即是對未知樣品進行準確鑒定，采用標準化實驗流程獲得未知樣品DNA條形碼序列，應用Blast分析、序列比對、建樹法、距離法等標準化鑒定流程確保未知樣品鑒定的準確性[5-6]。龍膽植物分類復雜，由于不同類群的特征性狀交叉重疊，各類型界限模糊不清，給其鑒定帶來非常大的困難。目前國內外對龍膽質量、藥用價值、藥理作用、生物分子遺傳多樣性等不同領域均有研究。本實驗采用DNA條形碼技術，對長白山不同地區(qū)龍膽植物和藥材進行鑒定研究，以期為規(guī)范龍膽藥材市場、準確鑒別藥材來源和資源評價提供參考。

1 材料

1.1 藥材

龍膽GentianascabraBunge植株采集于吉林省長白山10個不同地區(qū)，共31份，由長春中醫(yī)藥大學藥學院齊偉辰副教授鑒定，來源見表1。GenBank下載同屬植物ITS2序列10份，見表2。

表1 龍膽樣本來源

表2 龍膽屬植物ITS2序列

1.2 試劑

無水乙醇、三氯甲烷、氯化鈉、鹽酸(北京化工廠)；異丙醇、氫氧化鈉(天津市興復科技發(fā)展有限公司)；RNase A溶液(10 mg·mL-1，康為世紀生物科技股份有限公司)；溴化十六烷基三甲胺(CTAB)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙二鈉鹽(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；溴化乙錠(EB)溶液(上海捷瑞生物工程有限公司)；石蠟油[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.3 儀器

DK-S26型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)；WD-2105A型微型離心機、DYY-10C型電泳儀、WD-9403F型紫外儀(北京市六一儀器廠)；ETC811型基因擴增儀(蘇州東聯(lián)興業(yè)科學儀器有限公司)；JX-FSTPRP型全自動樣品冷凍研磨儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)。

2 方法

2.1 DNA提取

龍膽基因組DNA提取使用冷凍保存的葉片和根，采用改良的CTAB法提取DNA[7]。使用瓊脂糖凝膠電泳法及紫外分光光度計檢測DNA純度和濃度，提取DNA的A260 nm/A280 nm值為1.8～1.9(A表示吸光度)，質量濃度為4.85～6.50 μg·μL-1。

2.2 PCR擴增及測序

正向引物為5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物為5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。聚合酶鏈式反應(PCR)體系為20 μL，含PremixTaq10 μL、ddH2O 8 μL、FP(10 μmol·L-1)0.5 μL、RP(10 μmol·L-1)0.5 μL、DNA模板(100 ng·L-1)1 μL。PCR擴增反應步驟為95 ℃，5 min；95 ℃，15 s，55 ℃，15 s，72 ℃，1 min，40個循環(huán)；72 ℃，5 min；40 ℃保存[5]。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后進行雙向測序，測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2.3 數(shù)據(jù)處理

測序結果經(jīng)Chromas校正，并將序列運用SeqMan軟件進行拼接，根據(jù)峰圖基序列對比，去除質量差的部分，截取了250 bp長度的序列，并將截取的序列在GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫中Blast檢索并下載相似度高的龍膽、堅龍膽、筆龍膽、三花龍膽、高山龍膽、條葉龍膽序列。所有候選序列經(jīng)MEGA 7.0軟件自動比對分析堿基之間的差異，計算Kimura 2-parameter (K2P)遺傳距離及建立鄰接(NJ)聚類進化樹分析。聚類分析檢測選擇Bootstrap方法，重復1000次，鑒定各樣本。使Kimura 2-參數(shù)型作為氨基酸替代模型。

3 結果與分析

3.1 基于ITS2堿基序列的物種鑒定分析

共10個地區(qū)31個龍膽葉片及藥材樣本瓊脂糖凝膠電泳的DNA提取率為100%，ITS2序列擴增成功率為100%，測序成功率為100%，由測序后峰圖分析得知，各序列堿基相對分子質量>20，經(jīng)Blast比對確定31個樣本堿基序列為所需鑒定品種。

3.2 種內種間變異分析

龍膽屬植物41個樣本，經(jīng)SeqMan處理后，ITS2序列長度為205～210 bp。應用MEGA 7.0軟件做序列對比，41個樣品中有36個堿基變異位點。其中采集的龍膽樣品與GenBank下載的筆龍膽有21個變異位點、與三花龍膽有6個變異位點、與堅龍膽有21個變異位點、與高山龍膽共有19個變異位點、與龍膽均無變異位點。10個不同地區(qū)的龍膽之間也沒有堿基變異位點，見表3。

表3 基于ITS2堿基序列各龍膽屬樣本間的堿基變異位點

10個不同地區(qū)的龍膽及GenBank下載的龍膽種內遺傳距離為0，區(qū)分不明顯。筆龍膽與同屬各龍膽的種間遺傳距離為0.09和0.10，三花龍膽與同屬各龍膽的種間遺傳距離為0.03、0.09和0.10，條葉龍膽與除龍膽外的其他同屬龍膽的種間遺傳距離為0.09、0.10及0.03，堅龍膽與同屬各龍膽的種間遺傳距離為0.10、0.12和0.09，高山龍膽與同屬各龍膽的種間遺傳距離為0.07和0.11，區(qū)分明顯，見表4。

表4 基于ITS2堿基序列各龍膽屬樣本間的K2P遺傳距離

3.3 NJ樹聚類分析

基于41個樣本的ITS2序列建立NJ聚類進化樹，見圖1，可知采集的31個樣本和GenBank下載的龍膽及條葉龍膽聚為1支，其他龍膽屬各種植物都自聚為1支，其中筆龍膽為1支，三花龍膽為1支，高山龍膽為1支，堅龍膽為1支?？梢悦黠@地區(qū)分出龍膽屬多數(shù)不同種植物，雖然具有一定程度上的親緣關系，但仍然存在差別；同時結合變異位點及K2P遺傳距離可清楚發(fā)現(xiàn)，條葉龍膽和龍膽應用ITS2堿基序列區(qū)分種間差異較??；吉林省長白山10個不同地區(qū)的龍膽種內幾乎無差異，結合基于ITS2堿基序列變異位點、K2P遺傳距離比較、NJ聚類進化樹顯示得出，吉林省長白山藥用植物龍膽為同一種龍膽，無任何差異，鑒別成功率100%。

圖1 基于各樣本ITS2堿基序列建立的龍膽屬植物NJ聚類樹

4 討論

吉林省長白山10個不同地區(qū)龍膽葉片和藥材的ITS2序列沒有顯示出明顯的地區(qū)差異性，這與有效片段長度、取樣地的覆蓋度、道地藥材的性質有關。道地藥材從生物學內涵講是生物學上的居群，其產(chǎn)生除了與藥材特定的生態(tài)環(huán)境和特殊的采收加工技術有關外，還與該道地藥材產(chǎn)區(qū)內這一物種的地方種群或居群中遺傳上的特殊性有關。所以道地藥材的一個重要特征就是遺傳特征，應將其看作一個具有共同基因庫、由交配和親緣關系聯(lián)系起來的同一物種的個體群。因此，應用DNA分子遺傳標記鑒別方法，結合現(xiàn)代分子生物學手段，通過對遺傳信息的分析，能夠作為確定藥材道地性的手段之一[8-10]。本研究的樣本龍膽與從GenBank上下載龍膽的ITS2序列都能較好地區(qū)分，種內變異情況幾乎不可見。由此可見，運用ITS2序列對龍膽進行鑒別是有效可行且成功率較高的一種分子鑒定方法；本研究也為DNA分子鑒別應用在龍膽科其他屬或者其他中藥材的鑒別提供了參考。

龍膽屬藥用植物較多，有龍膽、三花龍膽、條葉龍膽、高山龍膽、堅龍膽等。本研究主要是對吉林省長白山地區(qū)藥用植物龍膽進行鑒別，提取了長白山10個不同地區(qū)的龍膽作對比，結果顯示，長白山各地區(qū)龍膽序列無差異，鑒定為龍膽；同時比較了龍膽與三花龍膽、條葉龍膽、高山龍膽、堅龍膽等其他各龍膽屬植物間的種間差異，龍膽屬植物皆有明顯區(qū)別。理想的DNA條形碼要有足夠的種間變異和較小的種內差異。DNA分子條形碼鑒別方法可以用于龍膽屬種間及種內鑒別。從分子生物學角度即基因層面進行研究，比較DNA堿基序列上的差異，不受樣品形態(tài)限制，減少了人為主觀因素影響，使鑒定結果更加準確，從而實現(xiàn)中藥鑒定標準化、自動化。