劉振峰， 劉代順， 劉建英， 周國旗， 李云飛， 曾靜新

(1.遵義醫(yī)科大學第三附院醫(yī)院/貴州省遵義市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 貴州 遵義 563000 2.貴州省遵義市紅花崗區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 貴州 遵義 563000)

ALI/ARDS的發(fā)生主要由直接和間接致傷因素導致毛細血管內(nèi)皮損傷和肺泡上皮細胞損傷引發(fā)肺泡水腫和彌漫性肺間質(zhì)，從而可造成急性低氧性呼吸功能不全[1]。ALI在臨床中病理生理特征主要以通氣/血流比例失調(diào)和肺容積減少等，嚴重者可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。研究發(fā)現(xiàn)嚴重感染和大面積燒傷患者的死亡與ALI存在明顯相關(guān)性，因此對ALI有效防治存在重要意義[2]。針對ALI臨床多采用小潮氣量進行保護機械通氣，以此降低死亡率。目前ALI發(fā)病機制尚未有明確報道，因此探尋新的治療方法已被諸多學者所關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在ALI和損傷機制中存在重要作用，且ALI發(fā)病機制中各細胞經(jīng)呼吸爆發(fā)大量產(chǎn)生活性氧從而造成氧化應(yīng)激的發(fā)生。正常生理情況下活性氧主要通過細胞內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件(ARE)進行調(diào)控相關(guān)抗氧化酶的降解和去除[3]。合成內(nèi)生性抗氧化酶中Nrf2是主要調(diào)節(jié)器，當Nrf2激活入核后直接參與了ARE的基因調(diào)控[4]。本文選取32只小鼠進行實驗，觀察內(nèi)毒素誘發(fā)ALI后，SF是否可激活Nrf2表達上調(diào)，從而起到保護ALI的作用，以期為臨床防治ALI提供新靶點。

1 材料與方法

1.1實驗動物:選取32只6～8周齡雄性小鼠均有廣東醫(yī)學實驗室提供(C57BL/6)，體重9～13g，飼養(yǎng)溫度21±2℃；隨機將32只小鼠分為SF組、對照組、SF溶劑組和ALI組，每組各8只。

1.2材料:SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒、Western blotting檢測、全蛋白試劑盒、血氣分析儀(GE premier3000)、IX51光學顯微鏡、凝膠成像分析系統(tǒng)、LPS、鼠抗人Nrf2單抗、蘿卜硫素、SOD、MPO、iNOS、IL-6和TNF-α試劑盒。

1.3模型制作:SF溶劑組和SF組均行腹腔注射20mg/kg(SF)，2次/d，每次間隔8h，連續(xù)注射3d；第4d時ALI組、SF組和SF溶劑組注射腹腔脂多糖(LPS)10mg/kg，并制備內(nèi)毒素誘發(fā)急性損傷模型；對照組腹腔注射10mg/kg生理鹽水；注射生理鹽水或LPS后6h，進行配制10%水合氯醛進行注射麻醉，再取腹主動脈血使用GE premier3000進行血氣分析，并同時計算氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)，急性肺損傷模型是否制備成功以氧合指數(shù)≤300mmHg(1mmHg=0.133kPa)為標準；下腔取血行肝素抗凝后立即自胸腔取出心肺組織。

1.4肺組織勻漿和干重/濕重比(W/D):依據(jù)上述方法處理后，將32只雄性小鼠進行處死，并立即自胸腔取出心肺組織；將左肺組織取出放入預冷生理鹽水玻璃勻漿器中充分勻漿；MPO檢測：制備10%組織勻漿，取0.45mL10%組織勻漿進行檢測；剩余組織勻漿采用低溫離心機進行離心(10000r/min)，離心10min，離心半徑6cm，采集上清液并放于-80℃中保存，備至各項檢測所用。將右肺尖葉肺組織取出進行稱重，放于烘箱中，溫度設(shè)定80℃，烘24h后面達到恒重量進行測定肺組織W/D比值。

1.5觀察肺組織病理:使用鹽水將右肺副葉肺組織進行浸洗后，采用福爾馬林(10%)進行固定，并經(jīng)梯度乙醇脫水置換，二甲苯透明后進行石蠟包埋，切片和染色后于IX51光學顯微鏡下觀察肺組織病理學結(jié)果，并對肺組織損傷結(jié)果進行評分；隨機選取每張切片10個視野進行觀察評分[5]，取平均值。

1.6檢測Nrf2核蛋白表達、IL-6和TNF-α水平含量:Nrf2應(yīng)用Western blotting檢測；使用Bradfo測定蛋白試劑盒提取的組織樣品蛋白；每孔加入20μg蛋白進行凝膠電泳、轉(zhuǎn)模和封閉后加入Nrf2一抗(1∶1000稀釋)并于4℃下過夜孵育，次日采用TBST漂洗3次后加入二抗(1∶10000稀釋)孵育后給予顯色，并應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)和Gel-Pro32軟件對結(jié)果進行灰度分析。IL-6和TNF-α水平含量采用ELIAS檢測。

1.7SOD、MPO和iNOS使用比色法檢測:嚴格根據(jù)試劑盒說明測定超氧化物歧化酶(SOD)、氧化物酶(MPO)和一氧化碳合酶(iNOS)的水平含量。

2 結(jié) 果

2.1觀察各組小鼠肺組織病理學和W/D比值:通過光鏡下可發(fā)現(xiàn)SF組、ALI組和SF溶劑組經(jīng)切片HE染色明顯可見炎癥反應(yīng)；對照組未見相關(guān)炎癥反應(yīng)的發(fā)生(圖1)。SF組、SF溶劑組和ALI組肺損傷評分明顯高于對照組，且W/D比值均高于對照組(P<0.05)；ALI組肺損傷評分和W/D比值高于SF組(P<0.05)；AIL組與SF溶劑組比較上述兩項指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 比較4組小鼠肺組織病理學評分和W/D比值

圖1 肺組織病理切片(HE×200)

2.2觀察SOD、MPO和iNOS水平:SF溶劑組和ALI組MPO和iNOS水平明顯較對照組升高，但SOD明顯低于對照組(P<0.05)；SF組SOD水平明顯較ALI組升高，但MPO和iNOS水平低于ALI組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；SF溶劑組與ALI組比較上述各項指標水平含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 比較4組肺組織SOD MPO和iNOS水平

2.3觀察各組血清IL-6和TNF-α水平含量:SF溶劑組和ALI組IL-6和TNF-α水平含量明顯較對照組升高(P<0.05)；SF組IL-6和TNF-α水平含量低于ALI組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；ALI組IL-6和TNF-α水平含量與SF溶劑組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表3。

表3 比較4組血清IL-6和TNF-α水平含量

圖2 比較4組小鼠肺組織Nrf2核蛋白表達

2.4觀察各組肺組織Nrf2核蛋白表達情況:SF溶劑組與ALI組Nrf2核蛋白表達明顯較對照組上調(diào)(P<0.05)；SF組肺組織Nrf2核蛋白表達明顯較ALI組上調(diào)(P<0.05)；ALI組與SF溶劑組比較Nrf2核蛋白上調(diào)表達情況差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

3 討 論

目前引發(fā)ALI的誘因較多，其中常見的內(nèi)毒素是致其發(fā)病的主要原因。研究顯示SF溶劑組和ALI組LPS注射6h后肺組織W/D比值明顯降低，而肺損傷組織評分明顯升高，說明模型建立成功。研究表明ALI組肺組織Nrf2核蛋白表達明顯較對照組上調(diào)，考慮Nrf2核蛋白表達的原因與LPS激活機體氧化應(yīng)激有關(guān)，從而引起內(nèi)源性免疫系統(tǒng)反應(yīng)升高Nrf2進行對抗損傷，但此保護作用不足以對抗炎癥介質(zhì)造成的損傷，因此最終結(jié)果顯示肺損傷程度加重。研究發(fā)現(xiàn)SF組肺組織Nrf2表達、W/D比值和抗氧化酶明顯較ALI組升高，且肺損傷評分和各項抗氧化應(yīng)激損傷指標低于ALI組(P<0.05)，說明SF可通過激活Nrf2表達減輕LPS誘導ALI的加重，造成氧化應(yīng)激損傷指標和促炎介質(zhì)降低，抗氧化酶升高等，有效起到了保護機體和調(diào)節(jié)作用。ROS造成的氧化應(yīng)激反應(yīng)在ALI發(fā)病機制中存在重要作用[6]。生理情況下ROS主要通過細胞內(nèi)ARE調(diào)控相關(guān)解毒和抗氧化酶的降解/去除。正常生理狀態(tài)下Nrf2定位于細胞漿，與Keaol結(jié)合成復合物[7]。當機體發(fā)生氧化應(yīng)激情況下，Nrf2磷酸化并自Keaol蛋白上解離后進入細胞核并于ARE結(jié)合，啟動其下游多個抗氧化基因和解毒酶進行轉(zhuǎn)錄翻譯，并以此進行對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[8]。研究發(fā)現(xiàn)[9,10]Nrf2/ARE信號通路在急性肺損傷中起到了重要保護作用，若將其阻斷可加快小鼠膿毒癥器官的損傷。Nrf2表達可通過SF進行上調(diào)表達，是Nrf2基因的重要激活劑[11]。本研究發(fā)現(xiàn)SF組Nrf2表達明顯較ALI組增加，且ALI組抗氧化酶、肺損傷組織評分和各項應(yīng)激損傷指標明顯低于SF組，證實SF可通過誘導Nrf2提高表達起到保護ALI的作用。本研究為SF對ALI的預防干預性研究，簡單探討了Nrf2/ARE通路在ALI中起到的作用。筆者將進一步研究SF聯(lián)合或?qū)Ρ绕渌寡趸瘎LI保護作用，且Nrf2/ARE通路具體的作用機制及是否有其他通路與之共同作用干預ALI的發(fā)生和發(fā)展也有待進一步探討。

綜上所述，SF可通過激活Nrf2/ARE對內(nèi)毒素造成的ALI損傷可起到明顯保護作用。