朱昌國(guó)， 李 帥， 孫艷君， 王玉濤， 孫 巖

(1.山東省濟(jì)南市人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科， 山東 濟(jì)南 271100 2.山東省濟(jì)南市中醫(yī)醫(yī)院周圍血管病科， 山東 濟(jì)南 250012 3.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院血管外科， 山東 濟(jì)南 250021)

全世界約有4.25億人罹患2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)，到2045年，這一數(shù)字可能增長(zhǎng)為6.93億[1]。糖尿病動(dòng)脈硬化(diabetic atherosclerosis, DA)是T2DM的并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致肢體缺血、糖尿病足等嚴(yán)重不良后果。T2DM誘發(fā)DA的具體機(jī)制尚不完全明確。小檗堿(berberine, BBR)屬生物堿，是中藥黃連的主要成分。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代藥理學(xué)研究的深入，BBR干預(yù)T2DM的效果已被證實(shí)[2]，且有研究表明，BBR具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[3]。在前期的研究中，本課題組利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)工具探索發(fā)現(xiàn)，BBR可能通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮治療DA的作用?；谏鲜隼碚摚n題組擬通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，觀察PI3K/AKT信號(hào)通路在DM模型大鼠腹主動(dòng)脈中的表達(dá)變化及BBR的干預(yù)作用，為DA的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)SD雄性大鼠70只，7周齡，體重(180±20)g。由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(魯)2019-0003。每籠飼養(yǎng)5只大鼠，自由飲水，室溫維持在(20±2)℃，普通全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器:見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器

1.3藥物及試劑

1.3.1實(shí)驗(yàn)用藥及制備：鹽酸小檗堿溶液(50mg/mL)：鹽酸小檗堿購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司，純度98%，黃色至橙色粉末。溶液制備方法：稱取10g鹽酸小檗堿，加入200mL生理鹽水混勻。

1.3.2主要試劑:見(jiàn)表2。

表2 主要試劑

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1建立動(dòng)物模型：① STZ溶液制備:用0.1M無(wú)菌檸檬酸鈉緩沖液配制濃度為1%的STZ溶液(PH 4.4)。②分組及造模:將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、糖尿病模型組(DM組)和鹽酸小檗堿干預(yù)組(BBR組)。DM組和BBR組大鼠禁食12h后，按照35mg/kg標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射STZ溶液；NC組大鼠腹腔注射相同劑量的無(wú)菌檸檬酸鈉緩沖液，造模72h后，尾靜脈取血測(cè)血糖，血糖≥16.65mmoL/L為造模成功[4]。排除造模過(guò)程中死亡和造模后未達(dá)標(biāo)的大鼠，每組選用20只開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

1.4.2干預(yù)方法：BBR組按照100mg/kg/d的標(biāo)準(zhǔn)每日灌胃給藥；DM組和NC組每日給予相同劑量的生理鹽水灌胃；每周根據(jù)大鼠重量調(diào)整用藥劑量，連續(xù)灌胃6周。

1.4.3標(biāo)本取材：各組大鼠禁食12h，按照3mL/Kg的標(biāo)準(zhǔn)，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，修剪腹毛，沿腹部正中進(jìn)入腹腔，顯露腹主動(dòng)脈，收集血液，將腹主動(dòng)脈標(biāo)本迅速置入4%多聚甲醛中固定。

1.4.4指標(biāo)檢測(cè):檢測(cè)各組大鼠血糖(GLU)、血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)變化；免疫組化法檢測(cè)PI3K、AKT、p21的表達(dá)水平，于顯微鏡下觀察標(biāo)本切片免疫組化染色的顯色，以細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。用Image J軟件測(cè)定標(biāo)本切片染色的平均光密度值(OD)。

2 結(jié) 果

2.1一般情況:造模前各組大鼠體重差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后，NC組大鼠正常進(jìn)食，體重平穩(wěn)增長(zhǎng)。DM組和BBR組大鼠活動(dòng)量減少，進(jìn)食飲水量增多，尿量增加。與NC組大鼠相比，DM組和BBR組大鼠體重明顯下降，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DM組與BBR組大鼠體重差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表3，圖1)。

表3 造模前后各組大鼠體重變化(g)

2.2血糖水平變化:造模后，DM組和BBR組大鼠血糖水平較造模前及NC組大鼠升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DM組和BBR組大鼠血糖水平差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)藥物干預(yù)后，BBR組血糖水平較治療前降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DM組和NC組大鼠治療前后血糖水平無(wú)明顯變化(P>0.05)(表4，圖2)。

表4 治療前后各組大鼠血糖水平變化(mmoL/L)

圖1 造模前后各組大鼠體重變化

圖2 治療前后各組大鼠血糖水平變化

2.3血脂水平變化：各組大鼠TC、TG治療前后差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各組大鼠之間TC、TG差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表5、6，圖3)。

表5 各組大鼠治療前后血清總膽固醇水平變化(mmoL/L)

表6 各組大鼠治療前后甘油三酯水平變化(mmoL/L)

圖3 各組大鼠治療前后血脂水平變化

2.4免疫組化結(jié)果：灌胃6周后，免疫組化檢測(cè)各組大鼠腹主動(dòng)脈PI3K、AKT、p21表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與NC組大鼠相比，DM組及BBR組大鼠PI3K表達(dá)水平明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與DM組相比，BBR組PI3K表達(dá)水平明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與NC組大鼠相比，DM組及BBR組大鼠AKT表達(dá)水平明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與DM組相比，BBR組AKT表達(dá)明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與NC組大鼠相比，DM組大鼠p21表達(dá)水平降低，BBR組大鼠p21表達(dá)水平明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與DM組相比，BBR組p21表達(dá)明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表7，圖4～8)。

表7 各組大鼠免疫組化結(jié)果(OD值)

圖4 各組大鼠PI3K免疫組化結(jié)果

圖5 各組大鼠PI3K免疫組化染色(×400)

圖6 各組大鼠AKT免疫組化染色(×400)

圖7 各組大鼠p21免疫組化結(jié)果

圖8 各組大鼠p21免疫組化染色(×400)

3 討 論

BBR是中藥黃連的主要成分。既往的研究證實(shí)，BBR可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善血管平滑肌細(xì)胞增殖和抑制炎性反應(yīng)等途徑發(fā)揮抗動(dòng)脈硬化作用[5]。此外，BBR還可以降低糖尿病模型大鼠的血糖水平，通過(guò)抑制炎性反應(yīng)、抗氧化等途徑干預(yù)糖尿病[6]。但BBR是否能調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路干預(yù)糖尿病動(dòng)脈硬化發(fā)病，尚缺乏研究。

本研究以糖尿病模型大鼠為研究對(duì)象，觀察BBR對(duì)模型大鼠腹主動(dòng)脈PI3K/AKT信號(hào)通路的干預(yù)作用。在動(dòng)物模型制備方面，鑒于STZ誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型的性別差異和年齡體重差異，本研究選用7周齡、體重(180±20)g的SD雄性大鼠為研究對(duì)象，采用STZ腹腔注射的方法制備糖尿病大鼠模型，模型大鼠均符合實(shí)驗(yàn)需求。

諸多研究證實(shí)，BBR可以通過(guò)改善胰島素抵抗、促進(jìn)胰島素及胰高血糖素樣肽-1的分泌、抑制肝臟糖異生、減少腸道細(xì)胞對(duì)糖的攝取吸收、抑制氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)、調(diào)控腸道菌群等途徑降低血糖水平[7]。結(jié)果表明，經(jīng)治療，BBR組大鼠血糖水平較治療前降低，且低于DM組大鼠血糖水平，再次證實(shí)了BBR的降糖作用。除血脂異常外，高血糖導(dǎo)致的炎性反應(yīng)是動(dòng)脈硬化發(fā)病的重要因素。研究證實(shí)，頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的檢出率與患者空腹血糖、血糖動(dòng)態(tài)變化以及糖化血紅蛋白的水平具有相關(guān)性，提示高血糖是發(fā)生動(dòng)脈硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[8]。此外，高血糖水平可以激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信號(hào)通路及其下游的細(xì)胞間黏附分子(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)的表達(dá)水平，促進(jìn)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)炎性因子的聚集和黏附，誘導(dǎo)動(dòng)脈硬化發(fā)病[9]。為驗(yàn)證高血糖對(duì)動(dòng)脈硬化發(fā)病的獨(dú)立影響，本研究采用鏈脲佐菌素腹腔注射的方法構(gòu)建糖尿病大鼠模型，以普通全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)并開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明，各組大鼠TC、TG治療前后以及組間比較差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明該造模方法未對(duì)大鼠血脂水平產(chǎn)生影響。

本研究采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)了模型大鼠腹主動(dòng)脈標(biāo)本PI3K、AKT、p21的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大鼠糖尿病模型復(fù)制成功后，其腹主動(dòng)脈PI3K、AKT的表達(dá)較正常對(duì)照大鼠顯著升高，而p21的表達(dá)則減少；經(jīng)BBR干預(yù)的糖尿病模型大鼠，腹主動(dòng)脈PI3K、AKT的表達(dá)較糖尿病模型大鼠減少，p21的表達(dá)增加。上述結(jié)果表明，糖尿病模型大鼠腹主動(dòng)脈PI3K、AKT的表達(dá)增加，p21的表達(dá)減少，這可能是糖尿病動(dòng)脈硬化發(fā)病的機(jī)制之一；BBR可以降低糖尿病模型大鼠血糖水平，減少其腹主動(dòng)脈PI3K、AKT的表達(dá)并上調(diào)p21的表達(dá)。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Phosphoinositide 3-kinases/protein kinase B, PI3K/AKT)信號(hào)通路廣泛參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化。近年來(lái)，PI3K/AKT信號(hào)通路參與動(dòng)脈硬化發(fā)病的研究愈加深入。已有研究證實(shí)，與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的多種信號(hào)分子與PI3K/AKT信號(hào)通路關(guān)系密切，PI3K/AKT信號(hào)通路可以通過(guò)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的途徑，干預(yù)動(dòng)脈硬化發(fā)病[10]。此外，研究證實(shí)PI3K/AKT參與炎性反應(yīng)和脂質(zhì)代謝途徑，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路能夠降低動(dòng)脈硬化模型小鼠血清游離脂肪酸、膽固醇和甘油三酯水平[11]。PI3K/AKT信號(hào)通路還可以抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等促炎介質(zhì)水平[12]。AKT是PI3K信號(hào)通路中處于核心地位的蛋白激酶。在PI3K作用下，AKT可被磷酸化為p-AKT，參與下游因子的激活。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，C57BL/6動(dòng)脈硬化模型小鼠的PI3K和p-AKT表達(dá)水平顯著提高[13]。內(nèi)皮細(xì)胞增殖是動(dòng)脈硬化發(fā)病的重要過(guò)程。p21是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases, CDK)的抑制因子，可以負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，即過(guò)表達(dá)p21，可抑制細(xì)胞增殖[14]。研究表明[15]，動(dòng)脈粥樣硬化病理狀態(tài)下，動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)p21表達(dá)減少，促使平滑肌細(xì)胞增殖，參與動(dòng)脈硬化發(fā)病。上述研究表明，PI3K/AKT信號(hào)通路與動(dòng)脈硬化的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

綜上所述，BBR可能會(huì)通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖等作用，干預(yù)糖尿病動(dòng)脈硬化發(fā)病。但糖尿病動(dòng)脈硬化病理過(guò)程復(fù)雜，且PI3K/AKT參與細(xì)胞增殖、凋亡等多種生理病理過(guò)程，本研究?jī)H驗(yàn)證了BBR對(duì)糖尿病動(dòng)脈硬化模型大鼠腹主動(dòng)脈PI3K/AKT信號(hào)通路的干預(yù)作用，未能對(duì)多靶點(diǎn)多通路在糖尿病動(dòng)脈硬化病理過(guò)程中的交互作用開(kāi)展研究，存在一定的局限性。糖尿病動(dòng)脈硬化的病理機(jī)制和治療靶點(diǎn)需要進(jìn)一步研究。