張金悅，陳文文，高飛，蘇明俊，孫東波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的高度接觸性豬腸道傳染性疾病[1]。全年均有發(fā)病，冬、春季多次發(fā)生[2]。在1971 年，英格蘭地區(qū)首次暴發(fā)該病，直到1978 年，該病大規(guī)模流行才被證實(shí)是由PEDV 引起的[3]。20 世紀(jì)70 年代，PED 疫情首次在我國上海地區(qū)得以證實(shí)[4]。2010 年，我國十幾個地區(qū)大規(guī)模地暴發(fā)了PED[5]，使得大量新生仔豬死亡，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成沉重的打擊[6-7]。美洲于2013 年首次暴發(fā)PED[8]，該病毒在不到一年的時間內(nèi)發(fā)生了突變，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9]。PEDV 主要感染新生仔豬，特別是7 天內(nèi)未斷奶仔豬，其死亡率高達(dá)90%~100%[10]。感染豬臨床表現(xiàn)為：萎靡不振、食欲下降、被毛粗亂，突發(fā)嘔吐和水樣腹瀉，糞稀如水呈噴射狀、顏色呈灰黃色或灰色，最終嚴(yán)重脫水而死[11]。病理變化主要表現(xiàn)為小腸變薄而透明，腸管膨脹，充滿淺黃色液體，腸黏膜充血出血，腸系膜淋巴結(jié)腫大，小腸絨毛變短，重癥者絨毛萎縮甚至消失[12]。糞-口傳播是PEDV 的主要傳播途徑，易感豬接觸到病豬或帶毒豬的糞便，從而通過口、消化道感染PED。該病毒也通過運(yùn)輸潛伏期的豬或受污染的飼料來感染健康的豬。有研究表明乳汁與精液也可以傳播PEDV[13]。最近幾年，PEDV 在世界范圍內(nèi)廣泛迅速傳播，我國也出現(xiàn)越來越多的疑似病例，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

PEDV 是一種單鏈RNA 病毒，屬于尼多病毒目（Nidovirales）、冠狀病毒科（Coronaviridae）、α 冠狀病毒屬（Alpha-Coronavirus）的I 群成員[14-17]。根據(jù)冠狀病毒的遺傳和抗原特征的不同，將冠狀病毒分為三組：第一組成員包括豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、貓冠狀病毒（FCoV）、豬呼吸道冠狀病毒（PRCoV）等；第二組成員包括牛冠狀病毒（BCoV）、豬血凝性腦脊髓炎病毒（PHEV）等；第三組成員包括火雞冠狀病毒（TCoV）、雉冠狀病毒（PhCoV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）等[18]。PEDV 病毒的纖突蛋白（S 蛋白）、膜糖蛋白（M 蛋白）和小包膜糖蛋白（E 蛋白）位于病毒粒子的外表面，核衣殼蛋白（N 蛋白）位于病毒內(nèi)部，N 蛋白與病毒基因組RNA 交織在一起形成病毒的核衣殼。糞便檢測到的病毒粒子是多形的，大多數(shù)是球形的，病毒粒子直徑在95 nm 與190 nm 之間，其平均直徑（包括纖突在內(nèi)）約為130 nm[19]。PEDV 基因組是單鏈的RNA，在5′端具有帽子（cap）結(jié)構(gòu)，3′端有一個poly（A）尾，基因組全長約27 000~31 000 nt[14]。PEDV 全基因組是由5′非編碼區(qū)（UTR）、3′非編碼區(qū)（UTR）和7 個開放閱讀框（ORF）構(gòu)成的[20]。

PEDV S 基因編碼的S 蛋白是以三聚體的方式存在的I 型糖蛋白。在病毒的細(xì)胞膜融合以及介導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過程中起著重要的作用[21]。PEDV S 蛋白由1 383 個氨基酸組成，胞外區(qū)人為劃分為S1 區(qū)（1-789 aa）和S2 區(qū)（790-1 383 aa）[22]。S1 結(jié)構(gòu)域主要識別細(xì)胞受體并與之結(jié)合，S2 結(jié)構(gòu)域主要在病毒膜融合時發(fā)揮重要作用[23]。S1 區(qū)相對S2 區(qū)承受更大的免疫壓力，具有更高的遺傳變異性[24-25]。因此，S1 基因常被作為分析PEDV 遺傳變異情況的靶向基因。

研究通過RT-PCR 技術(shù)對2018 年大慶市某規(guī)?；i場兩個分場的仔豬腹瀉樣品進(jìn)行PEDV 病原檢測，并對PEDV S1 基因變異情況進(jìn)行分析，旨為該場PED 的防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

采集2018 年大慶市某規(guī)模化豬場腹瀉仔豬的小腸組織及內(nèi)容物（來源于大慶市不同地區(qū)的兩個分場），每個豬場分別混合為一個樣品，共兩份樣品，儲存在-80 ℃冰箱中。

1.1.2 儀器設(shè)備（見表1）

表1 儀器設(shè)備Table 1 The instrument and equipment

1.1.3 主要試劑（見表2）

1.1.4 引物

參考PEDV CV777 毒株（GenBank 登錄號為AF353511）S1 基因保守區(qū)設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物。引物由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成，引物信息見表3。

表2 主要試劑Table 2 The main reagents

表3 PEDV S1 基因擴(kuò)增引物Table 3 Primers for the amplification of S1 genes of PEDV

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱取1 g 小腸組織及內(nèi)容物，加適量的液氮研磨，并將組織粉末倒入離心管中，加入3 mL PBS，渦旋5 min，6 000×g 4 ℃離心15 min，將上清移到新的離心管中并儲存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 病毒RNA 的提取

（1）將560 μL Carrier RNA 工作液加入一個干凈的RNase-Free 1.5 mL 離心管中；（2）將140 μL 組織上清液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，渦旋振蕩15 s，并短暫離心；（3）室溫靜置10 min；（4）將560 μL 4 ℃無水乙醇加入EP 管中，渦旋振蕩15 s，短暫離心；（5）將前一步中獲得的630 μL 液體加到置于收集管里的吸附柱CR2 中，蓋上管蓋，以8 000×g 離心1 min，倒出廢液，將吸附柱放回收集管中；（6）將離心管中剩余的所有液體加入吸附柱，蓋上管蓋，以8 000×g 離心1 min；（7）倒出廢液，將吸附柱放回收集管中，打開吸附柱蓋，向柱子中加入500 μL GD 溶液，以8 000×g離心1 min；（8）倒掉廢液，將吸附柱放回收集管，小心打開蓋子，向吸附柱中加入500 μL RW 溶液，以8 000×g 離心1 min。重復(fù)該步驟一次；（9）倒出液體，將吸附柱放回收集管，以12 000×g 空離5 min，棄去收集管中的液體；（10）將吸附柱放入收集管中，打開蓋子，在室溫放置3~5 min，讓吸附膜干燥；（11）將吸附柱放入一個RNase-Free 1.5 mL 離心管中，將50 μL RNase-Free ddH2O 加入到吸附膜中央并覆蓋住吸附膜，室溫放置3~6 min，以8 000×g 離心1 min。標(biāo)記含有病毒RNA 的離心管，并儲存在-40 ℃冰箱備用。

1.2.3 cDNA 合成

根據(jù)表4 加入反轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，輕輕混勻，短暫離心，25 ℃孵育5 min，42 ℃孵育1 h，70 ℃孵育5 min 終止。

表4 cDNA 反應(yīng)體系Table 4 cDNA reaction system

1.2.4 S1 基因擴(kuò)增

以合成的cDNA 作為模板進(jìn)行PEDV S1 基因的擴(kuò)增，目的片段擴(kuò)增大小約為2 396 bp。PCR 反應(yīng)體系見表5，反應(yīng)條件見表6。取3 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

表5 PCR 反應(yīng)體系Table 5 PCR reaction system

表6 PCR 反應(yīng)條件Table 6 PCR reaction condition

1.2.5 S1 基因的克隆和測序

參照凝膠回收純化試劑盒說明書，回收并純化鑒定為陽性的PCR 產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物連接到pGM-T載體上，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。步驟如下：（1）按照連接體系中的順序?qū)⒃噭┘尤氲?.5 mL 離心管中（連接體系見表7）；（2）輕彈離心管，混勻內(nèi)容物，并短暫離心，放入16 ℃金屬浴中連接16 h；（3）將50 μL TOP10 感受態(tài)細(xì)胞加入到連接產(chǎn)物中，輕輕混合，冰浴30 min；（4）將離心管置于42 ℃水浴90 s，取出離心管立即冰浴2~3 min；（5）向離心管中加入500 μL 預(yù)熱的SOB 培養(yǎng)基，置于37 ℃搖床，以150×g 培養(yǎng)45 min；（6）將菌液在離心管中混合后，將100 μL 菌液接種到Amp+抗性的LB 固體培養(yǎng)基，用無菌的玻璃涂布器涂開細(xì)胞，在培養(yǎng)箱中孵育12~16 h；（7）從每個平板上挑取單個菌落放入含有50 μL SOB 液體培養(yǎng)基的離心管中，將其作為模板進(jìn)行菌落PCR（同1.2.4），并通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。向搖菌管中加入5 mL Amp+抗性LB 液體培養(yǎng)基，再加入鑒定為陽性的50 μL 菌液，170 rpm 振蕩培養(yǎng)10~14 h，于EP 管中加入50 μL 甘油，再加入1 mL 陽性菌液混合均勻，送由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.6 同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建分析

使用Lasergene DNASTARTM5.06 軟件對測序成功的S1 基因進(jìn)行序列比對和同源性分析。使用MEGA 6.06 軟件中Phylogeny 功能采用NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用自展值為1 000 的p-distance 模型構(gòu)建進(jìn)化樹。

表7 連接反應(yīng)體系Table 7 Connection reaction system

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

通過RT-PCR 對兩個分場樣品進(jìn)行PEDV S1 基因檢測，結(jié)果顯示，獲得大小為2 396 bp 的目的片段，與預(yù)期大小一致，如圖1 所示，2 份樣品均為PEDV 陽性。

圖1 PEDV S1 基因PCR 鑒定圖Fig.1 The identification of PEDV S1 gene by PCR

2.2 膠回收鑒定結(jié)果

通過DNA 凝膠回收純化試劑盒，純化PEDV S1基因PCR 陽性產(chǎn)物，獲得與預(yù)期大小相符的單一目的條帶，如圖2 所示。

2.3 菌落PCR 擴(kuò)增結(jié)果

對挑取的單菌落進(jìn)行菌落PCR 鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增目的片段與預(yù)期的大小相符，獲得陽性菌落，如圖3 所示。

圖2 PEDV S1 基因PCR 產(chǎn)物純化鑒定圖Fig.2 Product purification of PEDV S1 gene by PCR

2.4 PEDV S1 基因序列同源性分析

研究成功獲得了2 株P(guān)EDV S1 基因序列，將成功克隆并測序的基因序列遞交NCBI 的GenBank 數(shù)據(jù)庫，獲得GenBank 編號為MK395356 和MK395357，同源性分析顯示鑒定毒株S1 基因的核苷酸同源性為98.3%，推導(dǎo)的氨基酸同源性為97.7%，與經(jīng)典毒株CV777 相比，核苷酸序列同源性為91.4%~91.6%，推導(dǎo)的氨基酸同源性為89.8%~89.9%。分析顯示實(shí)驗(yàn)鑒定毒株S1 基因與我國國內(nèi)流行HGC-01-2015 毒株、HLJ-QTH-2018 毒株同源性較高，與早期經(jīng)典毒株CV777、LZC 毒株、ZK-O 毒株同源性較低。PEDV S1 基因序列比對分析見表8。

圖3 PEDV S1 基因菌落PCR 鑒定圖Fig.3 The identification of PEDV S1 gene by colony PCR

表8 PEDV S1 基因序列分析Table 8 Sequences analysis of S1 genes of PEDV strains

續(xù)表8 PEDV S1 基因序列分析Continued table 8 Sequences analysis of S1 genes of PEDV strains

2.5 PEDV S1 基因遺傳進(jìn)化性分析

圖4 PEDV S1 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 The phylogenetic tree of PEDV S1 gene

PEDV S1 基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分成GⅠ群和GⅡ群，GⅡ群分成GⅡa 亞群和GⅡb 亞群，中國流行毒株以GⅡa 亞群和GⅡb 亞群為主[26]。試驗(yàn)鑒定的兩株P(guān)EDV 毒株屬于GⅡb 亞群第6 分支。GⅡb 亞群包括2011~2018 年中國部分流行毒株和美國高致病性毒株。實(shí)驗(yàn)鑒定毒株與GⅡb 亞群第6分支中2015~2018 年黑龍江省部分地區(qū)流行毒株親緣關(guān)系最近，與GⅠ群中的經(jīng)典CV777 毒株（Gen－Bank 登錄號AF353511）、2013 年美國高致病性毒株（GenBank 登錄號KF272920）親緣關(guān)系遠(yuǎn)。PEDV S1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖4。

3 討論

PED 最早于英國暴發(fā)，但并未成功分離出病毒。20 世紀(jì)70 至80 年代，歐洲多次出現(xiàn)PED 流行。1982 年，日本首次出現(xiàn)PED 疫情[27]。1993~1994 年，豬流行性腹瀉在日本再次流行[28]，1996 年，PED 又一次席卷了日本，約有8 萬頭豬感染PED，導(dǎo)致50%以上病豬死亡，哺乳仔豬死亡率從30%上升至100%。1993 年，PED 在韓國被首次報(bào)道，來勢洶涌，并呈現(xiàn)全國流行趨勢，所有年齡段的豬均發(fā)生腹瀉[29-30]。同年有研究人員對西班牙不同地區(qū)的794 個豬場采集的樣品進(jìn)行PEDV 血清學(xué)檢測，結(jié)果顯示PEDV 陽性率為29.6%，55.9%的豬場呈PEDV 抗體陽性[31]。2007 年，PED 疫情首次發(fā)生在泰國，在全國迅速流行，新生仔豬死亡率高達(dá)100%[32]。PED 疫情首次在美國暴發(fā)是在2013 年5 月，并迅速蔓延至美國14個州[33]。2010 年底，在我國南方地區(qū)許多豬場出現(xiàn)大規(guī)模、嚴(yán)重豬腹瀉暴發(fā)，而后不斷向北方蔓延，關(guān)于PEDV 的分子流行病學(xué)和遺傳演化分析得到了深入的研究。

有研究人員從2011 年底到2014 年3 月，對云南、廣西等29 個省份開展了豬群腹瀉疫情流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示在收集的1383 份腹瀉樣品中，利用RT -PCR 方法檢測到PEDV 陽性樣本686 份（49.58%）[34]。自2015 年起，研究人員對中國22 個省市開展了長達(dá)三年的豬群腹瀉疫情的流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明，在543 例腹瀉樣品中，66.85%（363/543）的腹瀉樣品為PEDV 陽性，除了PEDV 之外，在腹瀉樣品中還檢測到了大量致病原，包括豬捷申病毒（porcine teschovirus，PTV）、豬傳染性胃腸炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、豬薩佩羅病毒（porcine sapelovirus，PSV）、豬腸道病毒9/10（porcine enterovirus 9/10，PEV）、哺乳動物呼腸孤病毒（mammalian reovirus，MRV）、豬A 群輪狀病毒（porcine group A rotavirus，GARV）、 豬 星 狀 病 毒（porcine astrovirus，PAstV）、 豬 圓 環(huán) 病 毒（porcine torovirus，PToV）、豬細(xì)環(huán)病毒2 型（torque teno sus virus 2，TTSuV-2）、豬博卡病毒（porcine bocavirus，PBoV）、豬嵴病毒（porcine kobuvirus，PKV）和豬德爾塔冠狀病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV）；這些數(shù)據(jù)表明中國PED 的流行范圍非常廣泛，并且PEDV 是病毒性腹瀉的主要病原[35]。1978 年，PEDV被確定為豬流行性腹瀉（PED）的病原體[36]。該病的特征是急性水樣腹瀉、嘔吐和脫水，死亡率很高，新生兒仔豬的死亡率常常高達(dá)100%[10]。豬流行性腹瀉病毒（PEDV）是一種包膜、單股、正鏈RNA 病毒，屬于α-冠狀病毒屬[17]。PEDV 的出現(xiàn)給我國乃至全世界造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，并造成了重大的公共衛(wèi)生問題。

PEDV S 基因是編碼PEDV 結(jié)構(gòu)蛋白的基因中最易變異的基因[37]。S 基因被人為地劃分為S1 基因和S2 基因，通過序列比對發(fā)現(xiàn)，S2 基因相對保守，而S1 基因變異性較高[38]，S1 區(qū)比S2 區(qū)承受更大的免疫壓力[24-25]。故S1 基因常被用作研究PEDV 變異情況的靶向基因。實(shí)驗(yàn)檢測兩份腹瀉樣品均為PEDV 陽性，說明該豬場兩個分場均有PEDV 的流行。獲得的PEDV 毒株S1 基因核苷酸與氨基酸同源性高達(dá)98.3%和97.7%，鑒定的PEDV S1 基因序列同源性與國內(nèi)近幾年流行毒株具有高度同源性，而與早期經(jīng)典CV777 毒株同源性較低；PEDV S1 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，鑒定毒株與2015~2018 年的我國黑龍江省流行毒株親緣關(guān)系較近，與2015 年前國外流行毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。表明在該規(guī)?；i場流行的PEDV 毒株為PEDV 變異株。經(jīng)前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)兩個分場的所有生產(chǎn)母豬在分娩前42 天、21 天肌肉注射了疫苗廠生產(chǎn)的豬流行性腹瀉-豬傳染性胃腸炎二聯(lián)滅活苗，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該豬場流行毒株為PEDV變異株，以傳統(tǒng)疫苗株免疫豬不能提供理想的免疫保護(hù)，并且兩個分場之間一直有種豬運(yùn)輸，有研究表明，在PEDV 感染早期階段，病毒可通過污染的車輛、污染的道路及污染物迅速感染健康豬群[39]，以上因素均可導(dǎo)致新生哺乳仔豬發(fā)病率及病死率高。

目前，PEDV 具有較強(qiáng)的傳染性，且毒株極易變異，此現(xiàn)象與PEDV 為RNA 病毒具有易變異的特性有很大關(guān)系[40]，因此嚴(yán)格的生物安全措施為豬場提供了屏障，但是隨著我國養(yǎng)豬規(guī)模的不斷擴(kuò)大，使得豬種調(diào)運(yùn)頻繁，引進(jìn)種豬過程中部分豬場并未進(jìn)行有效的隔離與檢疫，帶毒豬進(jìn)入豬場后，PEDV 通過糞-口途徑感染健康豬，被PEDV 污染的飼料、工具、水等也成為了重要的傳染源，使得該病難以徹底消除，且呈持續(xù)性感染、逐年遞增的趨勢[41]。綜上所述，豬場應(yīng)定期消毒，禁止飼養(yǎng)工作人員在豬舍間頻繁走動，以最大程度減少PEDV 的傳播，同時引進(jìn)不帶毒的母豬，減少垂直傳播的可能。豬場工作人員應(yīng)提高飼養(yǎng)管理水平，做好定期檢測，及時淘汰亞健康母豬，因此，對于PED 的防控需要注重豬場的生物安全，做好相關(guān)工作。

4 結(jié)論

該規(guī)?；i場的兩個分場PEDV 檢測均呈陽性，且兩個分場流行的毒株均為PEDV 變異毒株。