王道涵 王素梅 趙榮華 付宗燕 衛(wèi)利 丁杰

摘要?目的：研究健脾止動湯對多發(fā)性抽動癥（TS）模型大鼠外周血、結腸、皮質、紋狀體細胞因子表達的影響。方法：采用亞氨基二丙腈（IDPN）腹腔注射法建立TS動物模型，將模型大鼠隨機分為空白對照組、模型組、泰必利組、健脾止動湯組。模型組和空白對照組給予0.9%生理鹽水灌胃，其余2組分別給予等體積的泰必利混懸液和健脾止動湯顆粒溶液，連續(xù)給藥6周。給藥結束后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）分別檢測大鼠外周血白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）、γ干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及結腸、皮質、紋狀體IFN-γ與TNF-α表達水平。結果：1）健脾止動湯組IL-1、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α表達顯著低于模型組（P<0.05）和泰必利組（P<0.05）;2）健脾止動湯組IFN-γ、TNF-α表達較模型組（P<0.05）和泰必利組（P<0.05）顯著下降;3）健脾止動湯組IFN-γ、TNF-α表達較模型組（P<0.05）和泰必利組（P<0.05）顯著下降，泰必利組IFN-γ、TNF-α表達較模型組無顯著變化（P>0.05）。結論：IDPN誘導TS模型存在免疫功能紊亂，健脾止動湯可抑制外周和中樞組織多種炎癥介質釋放，其抑炎作用可能對控制TS發(fā)作具有一定輔助調節(jié)作用。

關鍵詞?健脾止動湯;多發(fā)性抽動癥;亞氨基二丙腈;外周血;結腸;紋狀體;皮質;白細胞介素

Abstract?Objective：To study the effect of Jianpi Zhidong Decoction on the expression of cytokines in peripheral blood，colon，cortex and striatum of Tourette Syndrome （TS） model rats.Methods：The TS animal model was established by intraperitoneal injection of iminodipropionitrile （IDPN） and the rates was randomly divided into a blank control group，a model group，a Tiapride group，and a Jianpi Zhidong Decoction group.The model group and the blank control group were given 0.9% normal saline by gavage.The other 2 groups were given equal volumes of Tiapride suspension and Jianpi Zhidongtang Granule solution for 6 weeks.After the administration，enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，INF-γ，TNF-α and colon，The expression levels of INF-γ and TNF-α in the cortex and striatum.Results：1） The expressions of IL-1，IL-2，IL-6，IFN-γ，and TNF-α in the Jianpi Zhidong Decoction group were significantly lower than those in the model group （P<0.05） and Tiapride group （P<0.05）; 2 ） The expression of INF-γ and TNF-α in Jianpi Zhidong Decoction group was significantly lower than that of model group （P<0.05） and Tiapride group （P<0.05）; 3） INF-γ and TNF-The expression of α was significantly lower than that of the model group （P<0.05） and the Tiapride group （P<0.05）.The INF-γ and TNF-α expressions of the Tiapride group had no significant changes compared with the model group （P>0.05）.Conclusion：IDPN-induced TS model has immune dysfunction.Jianpi Zhidong Decoction can inhibit the release of various pro-inflammatory factors in peripheral and central tissues，and its anti-inflammatory effect may have a certain auxiliary regulatory effect in controlling the onset of TS.

Keywords?Jianpizhidong Decoction; Tourette syndrome; 3，3′-iminodipropionitrile; Peripheral blood; Colon; Striatum; Cortex; Interleukins

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.22.009

多發(fā)性抽動癥（Tourette Syndrome，TS）是臨床上較為常見的兒童神經精神類疾病之一，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢。傳統(tǒng)認識上傾向于遺傳、神經解剖及生化因素占主導地位。但就臨床實際來看，感染和免疫因素在TS發(fā)生中也占據了相當大比例。國內有研究顯示TS患兒細胞免疫存在異常表達，并與患兒抑郁情緒、社交恐懼、緊張焦慮等TS常見共患病密切相關[1]，由此表明免疫系統(tǒng)在某些神經精神類疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，或與中樞神經系統(tǒng)相互作用共同致病。

中醫(yī)認為，人體精神情志調節(jié)，血液生成、運輸以及免疫系統(tǒng)的有效運行有賴于肝主疏泄、脾主統(tǒng)血功能的正常發(fā)揮。課題組認為TS發(fā)病的中醫(yī)病機與脾虛肝亢密切相關，在此基礎上設立“扶土抑木”治法并創(chuàng)制健脾止動湯，前期研究顯示該方能不同程度糾正腦組織單胺類及氨基酸類遞質的異常表達，恢復TS鼠刻板運動行為以及運動興奮性，達到了中醫(yī)“平肝抑木”的治療理念。本研究擬從中醫(yī)“健脾扶土”為切入點，進一步觀察該方對TS鼠免疫系統(tǒng)及不同組織內細胞因子表達的調控作用。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?SPF級SD雄性大鼠32只，體質量（200±10）g（由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證號：SCXK（京）2012-0001），分籠喂養(yǎng)，自由飲食，溫度（24±3）℃，濕度：40%～60%。本實驗經北京中醫(yī)藥大學醫(yī)學與實驗動物倫理委員會批準，倫理審查編號：202022。

1.1.2?藥物及試劑?泰必利片（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，生產批號：H32025477）;健脾止動湯配方顆粒（太子參10 g、炒白術10 g、茯苓10 g、陳皮6 g、龍膽草3 g、當歸10 g、川芎6 g、鉤藤10 g、法半夏6 g，購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司，由北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院藥劑科負責制成免煎顆粒劑型）。96孔ELISA Kit，IL-1（批號：M170523），IL-2（批號：M170610），IL-4（批號：M170610），IL-6（批號：M170610），IL-10（批號：M170523），TNF-α（批號：M170523），IFN-γ（批號：M170523），上述試劑均購自北京百奧思科生物醫(yī)學技術有限公司。亞氨基二丙腈（IDPN，美國Sigma，批號：317306）。

1.1.3?儀器?酶標儀（Bio-Rad公司，美國，型號：680）;自動洗板機（北京拓普分析儀器公司，型號：DEM-3）;渦旋振蕩儀（海門其林貝爾儀器制造公司，型號：QL-902）;離心機（Eppendorf公司，德國，型號：Centrifuge 5415D）;分光光度計（Therno scientific科技公司，美國，型號：NANODROP 2000）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?SD大鼠分籠適應性喂養(yǎng)7 d，隨機分為模型組和空白對照組，前者予以腹腔注射IDPN[250 mg/kg，1 mL/（kg·d）]建立TS動物模型，空白對照組腹腔注射等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。大鼠全部表現(xiàn)出不同程度的刻板行為（頭部垂直或水平方向抽動，旋轉運動）增加，標志模型誘導成功[2]。成功后將模型組動物隨機分成模型組、泰必利組和健脾止動湯組，每組8只。

1.2.2?給藥方法?空白對照組、模型組給予等量0.9%生理鹽水;西藥組給予泰必利混懸液（10 mL生理鹽水約含21 mg原藥，相當于兒童臨床劑量的4.2倍）;中藥組給予健脾止動湯溶液（10 mL生理鹽水約含16 g生藥，相當于兒童臨床劑量4.2倍），4組均按照10 mL/kg灌胃給藥，1次/d，連續(xù)6周。

1.2.3?標本采集?末次給藥24 h后，斷頭取腦，低溫條件下快速剝離大鼠皮質及紋狀體，稱重后液氮快速冷凍，轉至-80 ℃冰箱保存待測。將收集于血清分離管中的全血標本在室溫放置2 h，然后1 000×g離心20 min，取上清液置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.4?ELISA檢測?分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。依次加入100 μL不同濃度的標準品及稀釋液，余孔加待測樣品100 μL，37 ℃溫育1 h。每孔加檢測溶液A工作液100 μL，37 ℃溫育1 h。棄去孔內液體，每孔用350 μL的洗滌液洗滌，浸泡1～2 min，重復洗板3次。每孔加檢測溶液B工作液100 μL，37 ℃溫育30 min。每孔加3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色。加終止溶液終止反應。450 nm波長測量各孔的光密度值（OD值）。依據公式：組織樣品含量=測定濃度/樣品濃度×樣品稀釋度進行計算。

1.3?統(tǒng)計學方法?采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數據進行處理，定量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊采用LSD檢驗，方差不齊采用Tamhane′s檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2?結果

2.1?外周血IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10含量比較?模型組外周血IL-1、IL-2、IL-6表達顯著高于空白對照組（P<0.05）、IL-10表達顯著低于空白對照組（P<0.05），健脾止動湯組IL-1、IL-2、IL-6表達顯著低于模型組（P<0.05）和泰必利組（P<0.05），IL-10表達顯著高于模型組（P<0.05），IL-4表達各組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2?外周血和結腸IFN-γ與TNF-α含量比較?模型組外周血及結腸IFN-γ、TNF-α表達顯著高于空白對照組（P<0.05），健脾止動湯組IFN-γ、TNF-α表達顯著低于模型組（P<0.05）和泰必利組（P<0.05）。見表2。

2.3?皮質和紋狀體IFN-γ與TNF-α含量比較?模型組皮質、紋狀體IFN-γ、TNF-α表達顯著高于空白對照組（P<0.05），健脾止動湯組IFN-γ、TNF-α表達顯著低于模型組（P<0.05）和泰必利組（P<0.05），泰必利組IFN-γ、TNF-α表達較模型組無顯著變化（P>0.05）。見表3。

3?討論

20世紀70年代后期有學者提出“心理神經免疫學”概念，它將人體行為、心理情緒、大腦神經活動、內分泌和免疫系統(tǒng)等學科相結合，形成了一門全新的綜合學科。此后，越來越多的學者開始關注免疫系統(tǒng)異常與某些神經精神疾病的相關性。鏈球菌感染后可出現(xiàn)TS癥狀。1998年Sweto等[3]首次定義了“與鏈球菌感染有關的小兒自身免疫性神經精神障礙（PANDAS）”，并在診斷標準中確立了“短暫的鏈球菌感染史”“神經精神癥狀出現(xiàn)或加重與感染相關”，該診斷肯定了感染因素介入以及免疫功能紊亂在TS等神經精神疾病發(fā)病中的地位。由此，以免疫系統(tǒng)為切入點的相關實驗研究開啟了TS病因學探討的全新視角。例如以自身抗體異常為研究對象發(fā)現(xiàn)抗神經元抗體、抗核抗體、抗細胞骨架抗體等在TS患者血清中含量明顯升高[4]，以B淋巴細胞為研究對象發(fā)現(xiàn)表面D8/17抗原陽性、CD19表面標志物陽性或成為TS和強迫障礙（OCD）易感性標志等[5]。

細胞因子是免疫原或其他刺激劑誘導的由免疫細胞和某些非免疫細胞合成并分泌的可溶性小分子蛋白，在免疫系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)、神經細胞和造血系統(tǒng)等廣泛分布[6-9]。作為神經和免疫系統(tǒng)信息傳遞的重要信使，它與神經遞質、內分泌激素等共同組成了機體細胞間的信號分子。根據細胞因子功能不同可分為白細胞介素（IL）、集落刺激因子（CSF）、干擾素（IFN）、腫瘤壞死因子（TNF）、趨化因子（chemokin）等。中樞炎癥介質對神經系統(tǒng)的影響具有顯著差異性，大體表現(xiàn)在影響信號轉導和基因調節(jié)進而改變興奮性/抑制性遞質的效應強度，通過炎癥反應造成腦細胞器質性損傷，以及促進腦細胞及其附屬結構的生長發(fā)育而改善腦功能等。以TNF-α為例，該物質由活化的Th1細胞產生，具有介導細胞免疫應答，促進細胞毒T細胞分化，激活巨噬細胞殺滅細胞內病原體的作用。有研究顯示，鏈球菌感染誘發(fā)的抽動障礙患兒Th1分泌亢進占主導地位，其血清TNF-α水平顯著升高;而以甲基苯丙胺誘導的刻板行為大鼠皮質星形膠質細胞內也出現(xiàn)TNF-α過度表達的情況[10-11]。盡管TNF-α本身對神經元無直接毒性作用，但其可通過誘導和刺激炎癥介質釋放，加劇腦組織損傷。

與中樞細胞因子直接誘發(fā)神經細胞損傷不同，外周血中細胞因子的變化往往與機體全身或局部免疫應答及炎癥反應有關。其對中樞神經系統(tǒng)的作用相對復雜，主要通過直接穿透血腦屏障作用;或介導血管內皮細胞活化，增加血腦屏障的通透性;或激活外周神經組織上某些因子受體，進而誘發(fā)氧化應激反應等。有研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖暴露下的孕中期大鼠，血清內升高的細胞因子可經脈絡叢和腦膜彌散進入仔鼠，并激活海馬、皮質和其他腦區(qū)星形膠質細胞和小膠質細胞IL-1β受體，使腦組織長期暴露在炎癥刺激下，子代可出現(xiàn)包括重復刻板行為在內的孤獨癥譜系障礙綜合征[12]。相較于外周血和腦組織，腸道黏膜血供及淋巴組織豐富，當腸道菌群受感染等因素刺激時釋放細胞因子，經腸道黏膜血運系統(tǒng)突破血腦屏障，這些遷移至腦內的細胞因子（如IL-1）通過與腦內巨噬細胞和小血管上皮細胞上特定受體（如IL-1受體）結合，從而干預中樞神經系統(tǒng)的生理活動[13-14]。國外研究表明，較早接受抗生素過度治療的兒童患自閉癥風險提高;自閉癥模型小鼠通過脆弱擬桿菌干預可改善腸道黏膜屏障功能及部分行為學癥狀[15-16]。

中醫(yī)采用傳統(tǒng)辨證思維，認為疾病的發(fā)生發(fā)展轉歸過程與邪正消長態(tài)勢密切相關。《黃帝內經》更是提綱挈領地指出：“正氣存內，邪不可干，邪之所湊，其氣必虛。”隨著臟腑營衛(wèi)氣血學說的建立，正氣的功能特點又進一步被延伸和細化，如主機能活動的元氣、主抗病能力的衛(wèi)氣、主康復能力的營氣。營衛(wèi)之氣運行于人體周身內外，具有防御外邪、營養(yǎng)臟腑、充實經絡的作用。二者受水谷精微化生，依賴脾胃之氣的強盛。脾氣健運，營衛(wèi)氣血充盛，可維持機體正常生命活力和防病抗病能力。五臟學說認為，脾主運化，主統(tǒng)血，它一方面作為后天精微物質的發(fā)源地滋養(yǎng)人體，另一方面又作為血液的調節(jié)器和過濾器負責其產生、加工和運輸。因此，中醫(yī)脾的涵義既包括現(xiàn)代解剖學中脾臟、胰臟、胃腸道等消化器官概念，同時又是重要的免疫器官，參與細胞免疫和體液免疫[17]。研究表明，脾虛狀態(tài)下的動物模型，其免疫功能呈現(xiàn)異常變化[18]。以細胞因子表達為例，王洪海和謝鳴[19]發(fā)現(xiàn)脾虛證大鼠血清細胞因子水平出現(xiàn)了IL-1β降低、IL-2、IL-6、TNF-α紊亂變化現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)脾虛證大鼠小腸組織IL-1β、IL-6水平顯著升高，而IL-2、IL-4水平顯著降低。錢會南和楊舒[20]發(fā)現(xiàn)脾虛證大鼠腦內海馬CA1區(qū)和下丘腦腹側核IFN-γ蛋白表達下降，IL-4蛋白表達增加。脾虛證病理模型的細胞免疫的狀態(tài)在不同組織器官出現(xiàn)了不同程度的應答紊亂和功能低下，這有可能是參與某些疾病發(fā)生發(fā)展的潛在因素之一。

外周血方面，模型組IL-1、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α表達顯著升高，IL-10表達顯著下降，IL-4未見改變，表明IDPN誘導TS大鼠出現(xiàn)外周炎癥反應，且呈現(xiàn)出促炎功能亢進，抑炎作用相對減弱的特點。結腸和腦組織方面，IFN-γ、TNF-α兩指標在模型組均呈現(xiàn)高表達，表明IDPN誘導TS大鼠腸道及腦組織存在炎癥反應。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，TS大鼠（包括藥物干預組）頻繁出現(xiàn)腹瀉或濕便，且腦實質呈現(xiàn)不同程度體積減小，上述實驗現(xiàn)象也佐證了IDPN誘導的動物模型可造成腸道和腦實質的炎性損傷。從實驗結果中可以看出，健脾止動湯組可顯著降低外周血IL-1、IL-2、IL-6含量，升高IL-10含量，并顯著降低外周血、結腸和腦組織中IFN-γ、TNF-α含量，而泰必利組僅對外周血IL-6，TNF-α以及結腸TNF-α有顯著降低作用。表明健脾止動湯能一定程度地抑制炎癥介質釋放，改善由于炎癥反應造成的中樞神經和外周組織損傷，而泰必利在免疫調節(jié)方面的作用并不明顯。

綜上所述，IDPN誘導TS動物模型可造成外周組織和中樞系統(tǒng)免疫功能紊亂。從免疫學角度來推測，大鼠接受腹腔注射IDPN后首先造成局部血液中炎癥介質釋放，使腸道在應激刺激下，進一步擴大炎癥反應并導致菌群功能紊亂。IDPN經血循環(huán)到達并破壞血腦屏障，由之前在外周組織形成的炎性因子或免疫復合物直接經受損屏障入腦，或間接刺激腦組織炎癥介質釋放，引起基底節(jié)和皮質區(qū)神經細胞炎性損傷。健脾止動湯可抑制上述炎癥反應，對外周和腦組織中細胞因子釋放具有不同程度地干預作用。從中醫(yī)角度來講，健脾止動湯“健脾扶土”抗抽動的治療理念并非促進“脾生血”以獲得更多有效成分，而是通過“脾運化”將血液中產生過多的致病成分逐一清除而實現(xiàn)的。由此可見，抑制促炎反應、恢復細胞因子表達水平有利于改善TS發(fā)作及相關腸道并發(fā)癥。不足的是，本研究未能從病理上給予有力驗證，但研究結果為我們從免疫學和微生物學探討TS發(fā)病機制提供了全新思路。

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（2020-10-23收稿?責任編輯：王明）