劉杰，熊亮，周勤梅，彭成，郭力

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所，四川 成都 611137)

“道地藥材”始見(jiàn)于《牡丹亭》，《神農(nóng)本草經(jīng)》中所謂“土地所出，真?zhèn)侮愋?，各有其法”?！侗静萁?jīng)集注》認(rèn)為“諸藥所生，皆有境界”[1]。歷代醫(yī)家很早就意識(shí)到了道地藥材的重要性。唐朝《新修本草》書(shū)中記載：“竊以動(dòng)植物生，因方舛性，春秋節(jié)變，感氣殊功。離其本土，則質(zhì)同而異”。孫思邈的《備急千金要方》稱(chēng)：“古之醫(yī)者，用藥必依土地，所以治十得九。”金代李杲在《用藥法象》云：“凡諸草木昆蟲(chóng)，產(chǎn)之有地，失其地，則性味少異?！苯沂玖颂囟ǖ纳鷳B(tài)環(huán)境對(duì)藥材質(zhì)量的影響[2-3]，強(qiáng)調(diào)區(qū)分產(chǎn)地，講究道地的重要性。

道地性是多種因素綜合作用的結(jié)果，涉及藥材的種源、栽培技術(shù)、地理環(huán)境、采收時(shí)節(jié)以及加工炮制等多個(gè)環(huán)節(jié)。在中醫(yī)藥的發(fā)展歷程中，醫(yī)藥學(xué)家結(jié)合看、摸、聞、嘗及水試、火試的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出了一些道地藥材的簡(jiǎn)單辨別方法，如“潞黨參”具有明顯的獅子盤(pán)頭和疣狀突起；寧夏枸杞以個(gè)大飽滿(mǎn)、皮薄色紅、肉厚籽小、味甜微苦等為特點(diǎn)；茅蒼術(shù)根莖上含有大量朱砂點(diǎn)；以及關(guān)防風(fēng)的“蚯蚓頭”、黃芪的“菊花心”等等。傳統(tǒng)鑒別方法為藥材質(zhì)量保證提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)[4-5]。但隨著引種、產(chǎn)區(qū)遷移、種源變化以及混淆品、摻雜品、偽品的層出不窮，包括附子新興產(chǎn)區(qū)的形成[6]、GAP基地與道地產(chǎn)區(qū)肉桂質(zhì)量類(lèi)似[7]、丹參代用品擬建議加入丹參新來(lái)源等[8]。簡(jiǎn)單的外觀性狀特征鑒別已不能滿(mǎn)足市場(chǎng)和生產(chǎn)的需求。同時(shí)道地產(chǎn)區(qū)藥材存在質(zhì)量參差不齊現(xiàn)象，使道地性研究進(jìn)展緩慢。技術(shù)的豐富帶來(lái)了諸多新設(shè)想，研究人員應(yīng)用DNA分子遺傳標(biāo)記、組織形態(tài)三維定量分析、中藥化學(xué)指紋圖譜和生物效價(jià)檢測(cè)等新技術(shù)，從遺傳物質(zhì)、表觀性狀、物質(zhì)基礎(chǔ)和生物效能等方面揭示中藥道地性的科學(xué)內(nèi)涵，為中藥道地性的研究提供參考。

1 DNA分子遺傳標(biāo)記

道地藥材的形成過(guò)程是基因與環(huán)境的雙重選擇，特定代謝產(chǎn)物的表達(dá)證明基因是道地性形成的關(guān)鍵因素之一[9]?；?qū)哟蔚奶接懼饕獊?lái)自分子遺傳標(biāo)記，包括DNA分子標(biāo)記和蛋白質(zhì)分子標(biāo)記[10]。從遺傳物質(zhì)出發(fā)，通過(guò)分析藥材的DNA多態(tài)性，發(fā)掘具有高度特異性的DNA片段，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析，從分子水平上揭示道地藥材中遺傳變異規(guī)律，進(jìn)一步闡釋道地藥材的遺傳成因。DNA分子標(biāo)記因其適用性廣得到更多的應(yīng)用，一般包括：AFLP、ISSR、RAPD、ITS和rRNA基因序列分析技術(shù)等類(lèi)型[11-12]。

郝明干等[13]首次提出將AFLP結(jié)合 SCAR 標(biāo)記的分子技術(shù)應(yīng)用到中藥材道地性的鑒別中，通過(guò)繪制不同產(chǎn)地中藥材的AFLP指紋圖譜證明遺傳多樣性，分析道地性產(chǎn)區(qū)藥材的特異性差異帶，進(jìn)一步設(shè)計(jì)出特異性 PCR 鑒別引物和鑒定試劑盒，從分子水平上鑒定道地藥材。王嵐等[14]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)17個(gè)居群川芎進(jìn)行遺傳背景分析，提出與生境、化學(xué)成分結(jié)合是道地性研究的新思路。ISSR分子標(biāo)記已廣泛運(yùn)用于枳殼[15]、石斛[16]、黨參[17]等道地藥材的遺傳多樣性評(píng)價(jià)。肖小河等[18]研究證明RAPD技術(shù)在正確鑒別姜黃屬不同種間群體的效果顯著，對(duì)種內(nèi)等級(jí)亦能進(jìn)行有效的劃分，可作為姜黃屬藥用植物的分類(lèi)鑒定與道地性評(píng)價(jià)的新手段。結(jié)合聚類(lèi)分析和化學(xué)圖譜技術(shù)對(duì)冬蟲(chóng)夏草[19]、前胡[20]、廣藿香[21]和當(dāng)歸等藥材的道地性鑒別和形成機(jī)制進(jìn)行了初步探索，特定遺傳標(biāo)記的確立成為了道地性研究的新方向。Hon等[22]也提出微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)在鑒別人參植物學(xué)特性和起源上優(yōu)勢(shì)明顯，可以在DNA水平的遺傳分析上做到標(biāo)準(zhǔn)化。蔡朝暉等[23]對(duì)不同居群金銀花的5S-rRNA基因間區(qū)序列變異和綠原酸進(jìn)行分析，得出成分差異及道地性的成因皆為基因變異所致。周聯(lián)等[24]以異地同種姜科藥用植物陽(yáng)春砂及市場(chǎng)流通品為研究對(duì)象，對(duì)其nrDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ITS)序列進(jìn)行了測(cè)定和分析，發(fā)現(xiàn)6個(gè)陽(yáng)春砂和綠殼砂的ITS-2序列完全一致，各樣品的5.8 S序列也完全一致，差異在于堿基位點(diǎn)的ITS-1上，提出ITS-1序列分析可評(píng)判陽(yáng)春砂的道地性。遺傳物質(zhì)是藥材道地性形成的重要內(nèi)在因素，各種DNA分子標(biāo)記技術(shù)被逐漸應(yīng)用于中藥道地性研究。黃璐琦等[25]提出道地性是特定遺傳背景、表性、時(shí)間及空間的綜合交互產(chǎn)物，及其化學(xué)組成也有特征的自適應(yīng)性。故結(jié)合化學(xué)成分、環(huán)境尋找道地藥材特定基因，為道地性研究帶來(lái)啟發(fā)。

2 組織形態(tài)三維定量分析

三維重建是針對(duì)生物醫(yī)學(xué)方面組織形態(tài)學(xué)二維資料的局限性而建立的對(duì)形態(tài)學(xué)參數(shù)和模型直觀描述的技術(shù)。三角形面元以及NURBS (非均勻有理B樣條)曲面的三維重建可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜中藥特征的三維重建與動(dòng)態(tài)顯示[26]。肖小河等[27]首次對(duì)中藥組織三維動(dòng)態(tài)及形態(tài)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，描述了中藥材麥冬的特征，劉峰群等[28]進(jìn)一步綜合應(yīng)用顯微圖像分析、Mas-Ⅱ計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，成功地鑒別了不同產(chǎn)地麥冬。此外，肖小河等還成功構(gòu)建了郁金類(lèi)中藥(黃絲郁金、綠絲郁金、溫郁金和桂郁金)的圖像[29]，建立了黃連(多源道地藥材)和姜黃屬藥用植物的顯微鑒定模式識(shí)別系統(tǒng)[30-31]。馮建紅等[32]利用等距抽樣法對(duì)兩個(gè)產(chǎn)地的防風(fēng)體視學(xué)參數(shù)的測(cè)定，較客觀地反映了各種組織的計(jì)量特征，已用于防風(fēng)藥材的產(chǎn)地鑒別。在凌秀華[33]的研究中發(fā)現(xiàn)福建和貴州太子參的區(qū)別表現(xiàn)在藥材表面皺裙程度的不同，玉竹不同產(chǎn)地藥材的橫切面組織特征皆存在顯著性差異。基于組織形態(tài)三維可獲得的直觀圖像，形象反映其他鑒別方法難于識(shí)別的道地藥材及其近緣品種和易混淆品種的區(qū)別。在研究道地中藥性狀鑒別過(guò)程中進(jìn)一步結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像分析、顯微圖像分析等技術(shù)，是傳統(tǒng)的鑒別技藝在現(xiàn)代的延續(xù)與創(chuàng)新，是更準(zhǔn)確、客觀地描述出道地性藥材的鑒定特征的方法。

3 中藥化學(xué)指紋圖譜以及含量測(cè)定

中藥化學(xué)指紋圖譜是對(duì)中藥化學(xué)成分信息的整體表征，是中藥材質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b定的重要手段。其中，高效液相(HPLC)、紅外光譜(IR)指紋圖譜最為常用，除此以外還包括了薄層色譜(TLC)、紫外光譜(UV)、質(zhì)譜(MS)和核磁共振(NMR)指紋圖譜等[34-35]。結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)中藥道地性成分進(jìn)行追蹤，使得中藥道地性研究具有一定的導(dǎo)向性[36]。

3.1 高效液相色譜

高效液相指紋圖譜是表征中藥化學(xué)成分整體性和特征性的常用技術(shù)。陳皮為傳統(tǒng)道地藥材，是廣東三寶之首、十大廣藥之一，據(jù)其產(chǎn)地的不同分為陳皮和廣陳皮[37]，然在藥典中的鑒別方式都是以其橙皮苷的含量來(lái)界定[38]。針對(duì)其道地性帶來(lái)的價(jià)格和效果差異而產(chǎn)生偽品、次品的問(wèn)題，羅艷等[39]研究人員建立了32批廣陳皮藥材和10批陳皮藥材的HPLC指紋圖譜，確定了17個(gè)共有峰、3個(gè)特征峰群，發(fā)現(xiàn)10批陳皮的共有模式并無(wú)特征峰A；且雖有特征峰群B、C，但二者的峰面積比例較32批廣陳皮藥材共有模式差異大，可作為道地性鑒別的重要條件。Miao等[40]對(duì)江油、布拖以及云南等產(chǎn)地的附子進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)江油道地產(chǎn)區(qū)附子有苯甲酰烏頭原堿特征峰，同時(shí)提出苯甲酰新烏頭原堿與新烏頭堿、單酯型生物堿與雙酯型生物堿的比例也可能是附子道地性標(biāo)志之一。Wang等[41]建立了甘肅定西地區(qū)當(dāng)歸的HPLC指紋圖譜，對(duì)比于其它產(chǎn)區(qū)的當(dāng)歸具有顯著的差異性，可用于當(dāng)歸的道地性評(píng)價(jià)。蘇建春等[42]建立了不同產(chǎn)地的黃芩的UPLC指紋圖譜，初步分析構(gòu)建了這幾個(gè)批次黃芩的判別函數(shù)模型，且對(duì)黃芩的產(chǎn)地判別正確率達(dá)到了96.9%。金立陽(yáng)等[43]通過(guò)對(duì)四川、廣西兩地澤瀉的HPLC-MS/MS結(jié)合不同分析手段，篩選出6種主要差異性成分，并提出采用差異性最大的澤瀉醇B的限量進(jìn)行產(chǎn)地的區(qū)別。

3.2 紅外光譜

紅外光譜技術(shù)以其操作簡(jiǎn)單、無(wú)損化、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)而被應(yīng)用于藥材產(chǎn)地的鑒別。孫素琴等[44]通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)區(qū)45批次的山藥進(jìn)行了紅外指紋圖譜的建立并結(jié)合聚類(lèi)分析的方法，得出道地與非道地的分析模型的區(qū)別極為顯著。Fan等[45]研究人員通過(guò)天麻的FT-IR測(cè)定，提出光譜耦合分析、成分分析和偏最小二乘-判別分析的結(jié)合可以作為不同產(chǎn)地天麻的鑒定手段。萬(wàn)洪善等[46]對(duì)姜黃紅外指紋圖譜結(jié)合模式識(shí)別和雙指標(biāo)分析，建立起分?jǐn)?shù)評(píng)定方法可對(duì)不同產(chǎn)地姜黃進(jìn)行鑒別。此外，研究者們應(yīng)用近紅外指紋圖譜法對(duì)黨參[47]、黃柏[48]以及蒼術(shù)[49]等具有明顯道地性的藥材進(jìn)行鑒別，為道地性藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣提供了參考。

3.3 太赫茲時(shí)域光譜

太赫茲時(shí)域光譜是新興的以太赫茲波為基礎(chǔ)發(fā)展而來(lái)的一種無(wú)損檢測(cè)技術(shù)，已經(jīng)運(yùn)用于許多領(lǐng)域中。太赫茲時(shí)域光譜在中藥的研究領(lǐng)域，大多數(shù)研究的是中藥材中所含的代謝物，其在光譜范圍內(nèi)的低頻振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)模式，為中藥材的研究提供新的光譜特征信息和鑒別依據(jù)[50-52]。徐哲等[53]運(yùn)用光譜匹配算法對(duì)不同產(chǎn)地的雞血藤和大血藤進(jìn)行了區(qū)別鑒定。張建等[54]運(yùn)用雙指標(biāo)序列法分析太赫茲光譜，成功建立對(duì)不同產(chǎn)地、不同品種莪術(shù)的區(qū)分方法。田珺宏[55]基于可視化算法和自編碼理論，建立了以川芎、羌活和貝母為例的產(chǎn)地、規(guī)格種類(lèi)的鑒別方法。郭帥[56]也通過(guò)太赫茲頻譜折射率和吸收系數(shù)的差別對(duì)牛膝、貝母等中藥的產(chǎn)地進(jìn)行鑒定。李小霞等[57]研究人員在對(duì)附子進(jìn)行太赫茲分析時(shí)提出吸收系數(shù)同制樣方法可以作為附子道地性鑒別需考慮的重要因素。

3.4 其它化學(xué)成分分析技術(shù)

隨著儀器分析技術(shù)的快速發(fā)展，多種分析手段的聯(lián)合應(yīng)用也在不斷加強(qiáng)，為中藥質(zhì)量的精準(zhǔn)把控提供了有力的保障。李然等[58]應(yīng)用GC-MS指紋圖譜技術(shù)，結(jié)合聚類(lèi)分析和主成分分析，建立了平江白術(shù)的質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)。黃璐琦等[59]通過(guò)GC-MS分析發(fā)現(xiàn)道地產(chǎn)區(qū)與非道地產(chǎn)區(qū)蒼術(shù)揮發(fā)油中蒼術(shù)酮、蒼術(shù)素、蒼術(shù)醇和β-桉葉醇的含量及比例上存在顯著差異，進(jìn)一步研究提出環(huán)境因子和遺傳因子的共同作用是道地藥材形成的關(guān)鍵因素。人參自古以來(lái)?yè)碛小鞍俨葜酢钡拿雷u(yù)，是東北三寶之首[60]，Yin等[61]通過(guò)對(duì)人參皂苷含量及其合成酶活性的研究，發(fā)現(xiàn)總皂苷含量與人參皂苷Re含量呈顯著相關(guān)，進(jìn)一步對(duì)其含量與HMGR、DS基因表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析，可作為人參產(chǎn)地鑒別的新方法。Yuan等[62]應(yīng)用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法建立了數(shù)十個(gè)產(chǎn)區(qū)浙貝母的元素指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)鎳元素為不同產(chǎn)區(qū)浙貝母中最具特征的元素，并可以作為鑒別浙貝母的方法。吳輝貴[63]首次將 CPMG 技術(shù)、STOCSY、二維 HSQC 和 HMBC 的結(jié)合應(yīng)用于不同產(chǎn)區(qū)杜仲化學(xué)成分分析，建立了杜仲的核磁共振指紋圖譜，并運(yùn)用于闡釋杜仲藥材的道地性。王蔚昕[64]通過(guò)電子鼻技術(shù)分析了不同產(chǎn)地當(dāng)歸的氣味，構(gòu)建了較為準(zhǔn)確當(dāng)歸道地產(chǎn)區(qū)的判別模型。

4 生物效價(jià)評(píng)價(jià)

生物效價(jià)測(cè)定是依據(jù)臨床功效對(duì)中藥的內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過(guò)中藥的主治和毒效，經(jīng)由相關(guān)的藥理作用直觀反映中藥品質(zhì)[65]，是近年來(lái)發(fā)展用于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、理化方法不能測(cè)定其含量、或不能反映其臨床生物活性的藥物評(píng)價(jià)方法。目前，研究者們利用生物效價(jià)對(duì)板藍(lán)根[66]、薏苡仁[67]和大黃[68]等多種藥材的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。肖小河等[69]首次提出將生物效價(jià)檢測(cè)引入對(duì)道地中藥研究中，并成功對(duì)不同產(chǎn)地黃連進(jìn)行了準(zhǔn)確的辨識(shí)[70]。陳二林等[71]從當(dāng)歸的活血角度出發(fā)，選擇抑制血小板聚集為指標(biāo)，利用生物評(píng)價(jià)模式對(duì)當(dāng)歸活血功效的差異性進(jìn)行了考察，提出此法可以作為不同產(chǎn)地當(dāng)歸綜合評(píng)價(jià)的依據(jù)。梁美美等[72]建立體外纖溶生物活性檢測(cè)方法評(píng)價(jià)地龍產(chǎn)地和炮制方法帶來(lái)的影響。王叢等[73]綜合抗菌、抗病毒作用以及穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量測(cè)定對(duì)不同產(chǎn)地穿心蓮進(jìn)行質(zhì)量控制。Wu等[74]提出綜合生物效價(jià)和生物標(biāo)志物是對(duì)中藥質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)的新視角。該評(píng)價(jià)體系直接與臨床療效密切相關(guān)，是中藥鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)“唯成分論”傳統(tǒng)模式研究的補(bǔ)充和完善。在產(chǎn)區(qū)為主導(dǎo)的情況下，環(huán)境、基源、栽培技術(shù)、炮制加工等也對(duì)藥材活性產(chǎn)生影響。生物效價(jià)評(píng)價(jià)作為道地藥材的參考標(biāo)準(zhǔn)還需進(jìn)行深入研究[65]。

5 討論與總結(jié)

中藥是一個(gè)多成分多靶點(diǎn)發(fā)揮作用的復(fù)雜體系，隨著研究的深入，以臨床為導(dǎo)向的中藥“品-質(zhì)-性-效-用”一體化研究已成為現(xiàn)代中藥研究的關(guān)鍵[75]。道地藥材即是醫(yī)藥學(xué)家基于中藥臨床療效優(yōu)選的產(chǎn)物。在“眼看、手摸、鼻嗅、口嘗”鑒別的傳承和發(fā)展基礎(chǔ)上，應(yīng)用DNA分子遺傳標(biāo)記、組織形態(tài)三維定量分析、中藥化學(xué)指紋圖譜和生物效價(jià)檢測(cè)等新技術(shù)，從遺傳物質(zhì)、表觀性狀、物質(zhì)基礎(chǔ)和生物效能等方面揭示中藥道地性的科學(xué)內(nèi)涵，為科學(xué)研究者提供一定的參考。目前，道地性的研究仍然是中藥研究中亟待突破的難點(diǎn)。它是一個(gè)綜合因素作用后形成的復(fù)雜體系，研究雖然已發(fā)現(xiàn)多種道地性藥材存在一定的特征性，但大多研究較為孤立和局限，未深入探究中藥道地與差異之間的關(guān)聯(lián)，因此形成一套道地性藥材評(píng)判體系具有重要的指導(dǎo)意義。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的分析技術(shù)可用于中藥道地性多層次的研究，同時(shí)也將不斷的融入其它的先進(jìn)技術(shù)，如質(zhì)譜成像技術(shù)、液相色譜-質(zhì)譜-核磁共振(LC-MS-NMR)聯(lián)用技術(shù)等。值得一提的是需要加強(qiáng)道地性的綜合性評(píng)價(jià)和分析，通過(guò)從不同產(chǎn)地大樣本量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以獲得可靠的數(shù)據(jù)，不斷追溯產(chǎn)生道地性的原因，揭示道地性差異的物質(zhì)基礎(chǔ)，將其與藥效學(xué)評(píng)價(jià)相結(jié)合，進(jìn)而系統(tǒng)全面地闡釋道地性藥材臨床應(yīng)用的優(yōu)越性。

道地性藥材是中醫(yī)藥的基石，是道地性理論的載體，充分體現(xiàn)中醫(yī)藥理論內(nèi)涵。道地性的研究任重而道遠(yuǎn)。為傳承中藥道地性的精髓，推動(dòng)中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，國(guó)家出臺(tái)了《全國(guó)道地藥材生產(chǎn)基地建設(shè)規(guī)劃(2018—2025年)》，明確提出推進(jìn)中藥材規(guī)范化種植。文山三七[76]、集安人參[60]、江油附子[77]規(guī)范化種植帶來(lái)的市場(chǎng)認(rèn)可有力地證明了GAP基地建設(shè)的必要性。區(qū)域控制標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一，GAP規(guī)范化種植可有效地改善同一產(chǎn)區(qū)藥材存在質(zhì)量差異的問(wèn)題。另外，存在道地藥材產(chǎn)區(qū)變遷的中藥材，如黃芩、丹參，姜黃和郁金等[78]，需加快對(duì)其進(jìn)行本草考證，促進(jìn)對(duì)道地藥材新舊產(chǎn)區(qū)的評(píng)估認(rèn)證，做到有跡可循、有理可依。