謝 姿， 馬曉瑭， 張惠婷綜述， 鐘望濤審校

腦血管疾病是我國乃至全球最嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)之一，具有高死亡率、高復(fù)發(fā)率和高致殘率[1]。由于血腦屏障(blood brain barrier,BBB)的阻礙，許多潛在治療藥物缺乏有效的遞送方式，它們的臨床應(yīng)用受到限制。因此迫切需要開發(fā)新的治療方法來克服BBB，提高療效。眾所周知，外泌體是一種由不同類型的細(xì)胞釋放到細(xì)胞外基質(zhì)的膜性小囊泡，廣泛存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清以及各種體液中，直徑約為30 nm～150 nm，是細(xì)胞外囊泡的最小亞型[2]。它們在被釋放的過程中攜帶有細(xì)胞來源相關(guān)的多種蛋白質(zhì)、脂類和核酸等生物大分子，是細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵參與者[3]。自從發(fā)現(xiàn)外泌體在細(xì)胞間通訊的作用以來，以外泌體為載體的治療藥物研究不斷發(fā)展[4,5]。與目前可用的人工藥物遞送載體相比，外泌體具有多種優(yōu)勢，首先，外泌體本身具有穿透BBB的能力，細(xì)胞靶向特性，其次，外泌體的循環(huán)穩(wěn)定性可以避免巨噬細(xì)胞的吞噬作用，延長化學(xué)藥物的半衰期[6]。因此，外泌體在給藥過程中顯著提高了某些可生物降解藥物的給藥效率，為腦內(nèi)藥物輸送提供了天然納米載體。本文概述了目前外泌體的載藥方式和腦靶向途徑，重點(diǎn)介紹了外泌體作為藥物載體介導(dǎo)的miRNAs、蛋白質(zhì)和化學(xué)藥物遞送在腦血管疾病中的治療應(yīng)用，并對目前外泌體載藥仍然存在的問題和挑戰(zhàn)進(jìn)行了討論。

1 外泌體載藥方式

外泌體的脂質(zhì)雙層膜可作為天然屏障保護(hù)負(fù)載的藥物，使其不會在血液中降解，極大地提高其治療效果。但是，這種膜以及外泌體內(nèi)源性成分的存在卻阻礙了外源治療藥物的裝載。因此，要將外泌體應(yīng)用于靶向治療，必須實(shí)現(xiàn)治療藥物的有效裝載。在此，將概述幾種不同的外泌體藥物裝載方法。

首先，最直接的方法是用需要負(fù)載的藥物直接孵育供體細(xì)胞，然后收集和純化用于疾病治療的治療性外泌體。這種方法主要用于小分子的負(fù)載。例如，MSCs和腫瘤細(xì)胞在與紫杉醇或甲氨蝶呤等化療物質(zhì)孵育時(shí)，能夠?qū)⑦@些化療藥物包裝在它們分泌的外泌體中[7]。對于基因治療，病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)(慢病毒、腺病毒)是用miRNA和siRNA轉(zhuǎn)染供體細(xì)胞的主要方法。通過使用這種預(yù)加載技術(shù)，MSC衍生的外泌體可將外源miRNA模擬物和pre-miRNA傳遞至人神經(jīng)祖細(xì)胞(NPC)和星形膠質(zhì)細(xì)胞[8]。盡管這種在外泌體生物發(fā)生過程中負(fù)載藥物的方法實(shí)現(xiàn)了外泌體在體外的藥物負(fù)載，但是由于外泌體內(nèi)生物發(fā)生過程的復(fù)雜性，它的負(fù)載效率較低且不受控制。為了提高加載效率開發(fā)了一種新方法，即通過光學(xué)可逆的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(EXPLORs)進(jìn)行蛋白質(zhì)負(fù)載的外泌體。，Yim等人[9]通過將藍(lán)光控制的可逆蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用模塊與外泌體生物發(fā)生的內(nèi)源性過程結(jié)合起來成功地將貨物蛋白裝載到新產(chǎn)生的外泌體中。

相比之下，將分離的外泌體與治療性分子一起孵育來進(jìn)行被動裝載不僅更簡單，而且受控且加載效率相對較高。例如，將外泌體與疏水性姜黃素一起孵育可將姜黃素有效地裝載和遞送到大腦中[10]。然而，簡單的孵育僅能達(dá)到疏水劑可接受的負(fù)載效率。為了獲得親水性治療劑的更高的裝載效率，Alvarez-Erviti等人[11]通過電穿孔將siRNA加載到純化的外泌體中，而外泌體的物理特性沒有實(shí)質(zhì)性改變。此外，皂苷透化、凍融循環(huán)、超聲處理和擠壓也已應(yīng)用于外泌體藥物的裝載。Haney等人[12]比較了上述將抗氧化酶過氧化氫酶裝載到單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞衍生的外泌體中的方法的裝載效率，發(fā)現(xiàn)通過超聲處理，擠壓和皂苷透化可以達(dá)到更高的裝載效率。這些主動的加載過程保持了外泌體的完整性，還保護(hù)了加載的過氧化氫酶免受循環(huán)降解的影響。將藥物裝載到外泌體的各種方法各有不同的裝載能力，這取決于藥物的特性，如親水性、疏水性和分子量。除了考慮載藥效率，外泌體膜的完整性和穩(wěn)定性在藥物傳遞中也很重要。如前所述，雖然通過超聲和擠壓將過氧化氫酶裝載到外泌體中可以獲得良好的酶活性，但也有研究發(fā)現(xiàn)膜完整性受損，膜結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)可能發(fā)生改變，從而影響載藥外泌體的治療效果。因此，有必要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

2 外泌體腦靶向途徑

外泌體具有基于供體細(xì)胞的天然靶向能力，不同類型的天然外泌體可以粘附不同的細(xì)胞。外泌體的這種天然靶向能力取決于外泌體的組成以及受體細(xì)胞的生理狀態(tài)。外泌體表面配體與大腦內(nèi)皮細(xì)胞受體之間的相互作用被認(rèn)為是主要機(jī)制。例如，幼稚巨噬細(xì)胞外泌體可以通過外泌體上整合素淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1(LFA-1)與細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上的碳水化合物結(jié)合性C型凝集素受體之間的相互作用穿過BBB[13]。除了穿越BBB的進(jìn)入途徑外，Grapp等人[14]還證明，外泌體也可以通過穿越脈絡(luò)叢中的腦脊液-腦屏障進(jìn)入大腦。他們發(fā)現(xiàn)，脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞產(chǎn)生的含葉酸受體-α(FRα)的外泌體可以穿過室管膜細(xì)胞層并分布到腦實(shí)質(zhì)中，從而被星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元攝取。這項(xiàng)研究提供了一種細(xì)胞特異性腦部藥物遞送途徑。

此外，還可用腦靶向肽編碼基因和外泌體蛋白質(zhì)標(biāo)記編碼基因的融合基因轉(zhuǎn)染祖細(xì)胞生成富含融合蛋白并具有穿越BBB能力的外泌體。例如，Alvarez等人[11]使用自衍生的樹突狀細(xì)胞來生產(chǎn)外泌體。通過對樹突狀細(xì)胞進(jìn)行修飾以表達(dá)Lamp2b(一種外泌體膜蛋白)，該蛋白與狂犬病毒糖蛋白(RVG)肽融合，可以通過乙酰膽堿能受體靶向神經(jīng)元來實(shí)現(xiàn)大腦靶向。鼻腔給藥也是外泌體穿過BBB并到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一種方式，鼻腔給藥的藥物主要通過嗅覺和三叉神經(jīng)通路被轉(zhuǎn)運(yùn)到大腦[10]。盡管許多研究已經(jīng)充分證明了鼻腔給藥后外泌體腦傳遞的可能性[15]，但具體機(jī)制尚待闡明。

3 外泌體載藥在腦血管疾病治療中的應(yīng)用

3.1 缺血性腦卒中 缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是一種常見的腦血管疾病，是老年人群嚴(yán)重殘疾和死亡的主要原因，占所有卒中的80%以上[16]。miRNAs是內(nèi)源性的非編碼小RNA分子，不僅可以作為卒中的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，同時(shí)也具有顯著的卒中治療潛力。miRNAs在細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是外泌體發(fā)揮作用的關(guān)鍵物質(zhì)[17]。例如，Hongqi Xin等人[18]發(fā)現(xiàn)MSC-外泌體可以將miR-133b轉(zhuǎn)移至神經(jīng)細(xì)胞促進(jìn)IS后神經(jīng)功能的恢復(fù)。誘導(dǎo)腦血管生成是改善IS損傷后功能恢復(fù)的關(guān)鍵。攜帶miR-181b的脂肪干細(xì)胞外泌體可以通過下調(diào)褪黑素7(TRPM7)水平促進(jìn)體外缺氧損傷后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成[19]。炎癥在IS的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，抗炎是腦卒中治療的重要靶點(diǎn)。Jiang等人[20]通過體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)負(fù)載miR-30d-5p的脂肪干細(xì)胞外泌體可以抑制自噬介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞向M1極化，抑制炎癥反應(yīng)，減少梗死面積。環(huán)狀RNA(Circ RNA)是一種分布廣泛、細(xì)胞功能多樣的內(nèi)源性非編碼RNA的新成員。研究顯示外泌體負(fù)載Circ RNA SCMH1傳遞增強(qiáng)了IS模型的神經(jīng)可塑性，抑制了膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性和外周免疫細(xì)胞的浸潤，促進(jìn)了IS后的功能恢復(fù)[21,22]。

除了上述提到的RNA，外泌體還可以通過遞送蛋白質(zhì)、藥物和激素等來參與IS治療。如，來自血漿的外泌體可以遞送熱激蛋白70(HSP70)至腦缺血區(qū)域，抑制HSP70介導(dǎo)的活性氧生成，減少BBB破壞并防止線粒體損傷保護(hù)缺血再灌注損傷后的腦組織[23]。外泌體可以將藥物依達(dá)拉奉輸送到IS大鼠的缺血側(cè)，并靶向神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞減少神經(jīng)元死亡抑制神經(jīng)炎癥[24]。同樣，運(yùn)載褪黑素的外泌體也被證明對缺血誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有很好的治療作用[25]。

綜上，外泌體通過裝載某些特定內(nèi)含物,如microRNA、Circ RNA、蛋白質(zhì)等在神經(jīng)、血管生成及炎癥方面來影響IS的治療和預(yù)后，很多干細(xì)胞來源的外泌體發(fā)揮了比干細(xì)胞本身更具優(yōu)勢的治療作用，未來或許能為發(fā)揮干細(xì)胞治療更大的潛力。但目前大部分研究還只在細(xì)胞和動物模型階段進(jìn)行，從臨床試驗(yàn)層面來探討外泌體承載的藥物對IS的療效研究亟待開展。

3.2 腦出血與蛛網(wǎng)膜下腔出血 腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是卒中最具破壞性的亞型，占所有卒中患者的10%～15%[26]。Zhang等人[27]發(fā)現(xiàn)裝載miR-21的MSCs-外泌體可以為ICH的治療提供一種新的方法，減輕ICH后繼發(fā)性損傷引起的神經(jīng)元死亡和腦血腫。富含miR-146a-5p的MSCs-外泌體可以減少腦出血后的神經(jīng)元凋亡，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化，從而保護(hù)和改善損傷后的神經(jīng)功能[28]。蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是ICH的一種常見類型，外泌體介導(dǎo)的miRNA遞送也為SAH的治療提供了新的方向。例如，在體內(nèi)用miR-206-knockdown修飾的外泌體治療后,通過靶向腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，可以治療SAH后的神經(jīng)功能缺損和腦水腫并抑制神經(jīng)元凋亡[29]。Sun等人[30]發(fā)現(xiàn)miR-630高表達(dá)修飾的外泌體可以逆轉(zhuǎn)SAH后內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的異常。

3.3 腦動脈粥樣硬化 腦動脈粥樣硬化是腦血管疾病的主要原因。參與動脈粥樣硬化的大多數(shù)細(xì)胞可以產(chǎn)生外泌體。因此，外泌體介導(dǎo)的miRNA或反義miRNA傳遞可被視為治療腦動脈粥樣硬化的工具。例如，miR-126、miR-145和miR-155都有希望用治療腦動脈粥樣硬化，miR-126過表達(dá)介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞外泌體具有抗動脈粥樣硬化作用[31]，內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)剪切反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Kruppel樣因子2(KLF2)的外泌體通過輸注ApoE-/-小鼠可減輕動脈粥樣硬化斑塊[32]。然而，使用外泌體進(jìn)行腦動脈粥樣硬化的治療性輸送仍處于初步階段，要想發(fā)揮外泌體在腦動脈粥樣硬化治療上更大的潛力還需要更多的努力。

3.4 顱內(nèi)動脈瘤 顱內(nèi)動脈瘤(intracranial aneurysm,IA)的自發(fā)破裂是患者發(fā)病和死亡的主要原因。目前顯微手術(shù)夾閉術(shù)及血管內(nèi)介入栓塞術(shù)是預(yù)防IA的主要臨床治療手段。但是，對于具有高手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)或無法手術(shù)的IA患者，則需要開發(fā)非手術(shù)創(chuàng)新療法。第一個關(guān)于外泌體對IA破裂治療效果的研究報(bào)道是由Liu等人[33]提出的，研究發(fā)現(xiàn)在IA的小鼠模型中靜脈應(yīng)用MSC-外泌體可將IA破裂率降低39%。在用外泌體處理的肥大細(xì)胞中也觀察到前列腺素E2(PGE2)產(chǎn)生和其受體EP4表達(dá)的上調(diào)。而在小鼠中對外泌體施用選擇性EP4拮抗劑可消除外泌體對IA破裂的治療作用。這提示外泌體介導(dǎo)的特定種類的表面受體或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移可能是外泌體對IA治療作用的潛在機(jī)制。

3.5 腦小血管病 腦小血管病(cerebral small vessel disease,CSVD)是一類廣泛的腦血管疾病，主要影響具有多種不同病因的穿孔小動脈，毛細(xì)血管和小靜脈。是老年人認(rèn)知能力下降的主要原因[34]。CSVD的病理生理機(jī)制尚不清楚。關(guān)于外泌體在CSVD中的治療應(yīng)用也甚少，迄今為止，僅Josie C等人[35]報(bào)道在CSVD患者中發(fā)現(xiàn)循環(huán)外泌體中miR-17家族的多個miRNA的表達(dá)增加，但其在CSVD中的作用機(jī)制還不明確。因此，進(jìn)一步闡明miR-17家族在CSVD的作用機(jī)制對CSVD的診斷和治療十分重要，未來可能是通過外泌體藥物遞送治療CSVD的新靶點(diǎn)。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，外泌體作為一種天然、新穎的藥物遞送載體，為藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)開辟了一條新途徑。首先，外泌體的粒徑很小，并且對于血腦屏障具有很高的滲透性。其次，外泌體是內(nèi)源性物質(zhì)，可以從患者體內(nèi)分離出來，因此大大降低了毒性和免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)。此外，來自特定細(xì)胞的外泌體包含天然治療分子，這對于闡明發(fā)病機(jī)理和發(fā)現(xiàn)天然藥物具有重要意義。但是，要將外泌體作為腦部藥物遞送載體應(yīng)用于臨床實(shí)踐仍然存在許多需要解決的問題。首先，外泌體所遞送藥物的有效性和安全性，其獲得的便捷性和經(jīng)濟(jì)性，以及體內(nèi)使用的穩(wěn)定性和安全性是解決問題的關(guān)鍵。此外，對于腦中外泌體是如何實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間通訊以及如何進(jìn)入大腦并將其貨物運(yùn)送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)制還不夠清楚。闡明上述機(jī)制將對外泌體介導(dǎo)的腦部藥物遞送和腦血管疾病治療產(chǎn)生重要影響。目前，解決上述問題以及如何發(fā)揮外泌體最大的臨床潛力仍然需要多學(xué)科的共同努力。