申子萌，王希，徐悅，陳麗

（1.黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱 150080；2.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；3.國(guó)家糖料改良中心，哈爾濱 150080；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；5.黑龍江省甜菜技術(shù)創(chuàng)新中心，哈爾濱 150080）

0 引言

基因是指最終用于形成蛋白質(zhì)或各種功能性RNA 所必需的全部核苷酸序列，從而指導(dǎo)植物體的生長(zhǎng)發(fā)育等代謝過(guò)程。對(duì)基因結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，前提是通過(guò)基因克隆技術(shù)獲得基因本身的片段。廣義的基因克隆是借助酶切與連接形成重組質(zhì)粒即克隆載體，將分離出所需要的目的DNA 片段轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞，從而鑒定、篩選、保存含有目的DNA 片段的個(gè)體[1]。整個(gè)過(guò)程可概括為：分、切、連、轉(zhuǎn)、選[2]。一般而言，基因克隆包括4部分的工作：目標(biāo)DNA 片段的獲?。础胺帧保?、克隆載體的構(gòu)建（“切、連”）、寄主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（“轉(zhuǎn)”）、重組體克隆的選擇和鑒定（“選”）。除此之外，通常在提取目的基因后需要進(jìn)行生物信息學(xué)分析來(lái)判斷序列的結(jié)構(gòu)與功能[3]。

本研究所綜述的基因克隆實(shí)現(xiàn)方法，指廣義的基因克隆所涉及的基因片段獲取、早期分析與載體構(gòu)建的實(shí)現(xiàn)方法。由于植物的生長(zhǎng)發(fā)育在時(shí)間和空間上受到不同基因的影響，而不同的基因在植物體內(nèi)行使的功能也不同，并且基因在表達(dá)上或存在形式上的時(shí)空差異性又可能影響基因克隆方案的選擇，因此需要對(duì)植物中控制不同功能和性狀的基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能方面的了解，以期確定某基因行使的功能，并在性狀改良乃至產(chǎn)業(yè)發(fā)展中進(jìn)行應(yīng)用。

1 目的DNA片段的獲取

在基因克隆的過(guò)程中，目的片段的獲取是至關(guān)重要的，目的基因獲取，即狹義的基因克隆，又稱基因分離，是通過(guò)克隆擴(kuò)增，獲得可進(jìn)行研究或應(yīng)用的某個(gè)基因，形式通常是DNA片段。而獲得目的基因通常有4種方法：化學(xué)法直接合成基因、從基因組文庫(kù)中釣取、從cDNA文庫(kù)中釣取目的基因、通過(guò)PCR擴(kuò)增出目的基因。

1.1 化學(xué)法直接合成基因

化學(xué)合成法要求已知目的基因的核苷酸序列或相對(duì)應(yīng)的多肽鏈氨基酸序列，并且DNA 片段較短，具有專一性和定向性。其原理是通過(guò)縮合反應(yīng)合成特定的寡核苷酸鏈。常用于合成PCR 引物、寡核苷酸探針、人工接頭及較小的基因，用于基礎(chǔ)生物學(xué)研究和生物科技應(yīng)用領(lǐng)域等。至今，化學(xué)法直接合成基因可以利用PCR技術(shù)和基于非聚合酶循環(huán)反應(yīng)（PCA）的策略來(lái)實(shí)現(xiàn)方便、快速地合成目的基因[4-5]。近年來(lái)，利用化學(xué)法合成基因的研究較多，如：使用化學(xué)方法對(duì)堿基修飾的核糖核酸-5'-O-三磷酸鹽進(jìn)行克級(jí)合成[6]；細(xì)菌基因組的合成，開(kāi)辟了化學(xué)法合成基因的前景[7]。此外，蛋白質(zhì)的化學(xué)合成也已經(jīng)成為一種普遍適用的技術(shù)，在體內(nèi)外都可合成具有定制特性的蛋白質(zhì)[8]。全化學(xué)合成蛋白質(zhì)的方法更加方便、快捷[9]。

1.2 從基因組文庫(kù)中釣取目的基因

由于基因組文庫(kù)內(nèi)含有某一生物完整的基因組信息，可使用DNA 探針從基因組文庫(kù)中獲得目的基因?；蚪M文庫(kù)構(gòu)建通常包括兩個(gè)部分：（1）染色體DNA 片段和載體DNA 片段的制備；（2）將染色體DNA 片段與載體連接。組建基因組文庫(kù)的手段一直在更新，如：利用繞過(guò)限制甲基化DNA 的限制修飾系統(tǒng)高效構(gòu)建異種基因組文庫(kù)[10]。對(duì)高粱種子進(jìn)行化學(xué)誘變建立系譜突變文庫(kù)，在高粱改良中具有優(yōu)勢(shì)[11]。此外，利用圖位克隆的方法已建立了谷子突變體基因組文庫(kù)[12]。

1.3 從cDNA文庫(kù)中釣取目的基因

由于cDNA文庫(kù)能夠快速擴(kuò)增目的基因，并且不受內(nèi)含子的干擾，操作較簡(jiǎn)單，工作量也較少，因此在建立真核生物基因文庫(kù)時(shí)常常首選cDNA 文庫(kù)。建立cDNA文庫(kù)的主要步驟包括：總RNA 的提取和純化、cD‐NA 的合成、cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建[13]。關(guān)于cDNA 文庫(kù)建立的報(bào)道一直在增加，如利用SMART 技術(shù)構(gòu)建耳癢螨（Otodectes cynotis）全長(zhǎng)cDNA 文庫(kù)，為其進(jìn)一步進(jìn)行RNA 測(cè)序和功能基因研究奠定了基礎(chǔ)[14]；采用Mate &Plate?酵母雙雜交文庫(kù)方法，從獼猴桃幼葉信使RNA構(gòu)建了獼猴桃cDNA文庫(kù)[15]。

1.4 通過(guò)PCR直接擴(kuò)增出目的基因

PCR技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)[16]，已成為克隆研究最常用的方法[17-18]。例如，利用數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)各種HIV基因組目標(biāo)可進(jìn)行總HIV DNA定量分析[17]。

當(dāng)目的基因序列未知或不夠準(zhǔn)確時(shí)，則可通過(guò)不同的PCR 引物設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)目的基因的擴(kuò)增?，F(xiàn)有方法包括反向PCR、錨定引物PCR、隨機(jī)引物PCR、RACE等。如，采用反向PCR 技術(shù)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增[18]，利用水稻基因組中的Bar基因設(shè)計(jì)錨定引物[19]，使用任意引物的PCR，多次循環(huán)擴(kuò)增，并通過(guò)計(jì)算選擇獲得一組序列標(biāo)記，用于宏基因組比較的方法[20]，利用RACE技術(shù)對(duì)花生的FAR1-5 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行克隆[21]，等等。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR 技術(shù)也在不斷創(chuàng)新，從傳統(tǒng)的PCR技術(shù)到RT-PCR[22]、qRT-PCR[23]、M-PCR[24]等技術(shù)，到仍然在不斷創(chuàng)新的COLD-PCR[25]、SOE-PCR[26]、恒溫?zé)岣艚^式PCR[27]等，PCR技術(shù)的種類和應(yīng)用領(lǐng)域仍在不斷擴(kuò)大。

2 生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析是基因克隆在序列和功能分析方面的重要手段，通常是指在具有計(jì)算機(jī)和生物學(xué)等多方面知識(shí)的基礎(chǔ)上，使用相關(guān)軟件，對(duì)基因從序列水平進(jìn)行分析的過(guò)程。在植物基因克隆方面，主要集中在核苷酸序列和氨基酸序列兩方面進(jìn)行分析[28-29]。在得到目的基因之后，通常會(huì)先對(duì)其進(jìn)行基本特征的生物信息學(xué)分析，從序列結(jié)構(gòu)、編碼區(qū)完整性、序列相似性等角度評(píng)價(jià)基因克隆的效果，并對(duì)基因產(chǎn)物的基本特征進(jìn)行預(yù)測(cè)[30]。利用的分析工具包括Blastn、Blastx、Dnaman、Clustal等單機(jī)或在線軟件。此后則是對(duì)基因的編碼產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的分析，從蛋白質(zhì)水平進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能的預(yù)測(cè)。隨著生物基因測(cè)序的不斷完成和生物信息學(xué)分析手段的多元化，生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能不斷被挖掘[31]。對(duì)于蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)常采用nnPre‐dict、Predictprotein 等工具，三級(jí)結(jié)構(gòu)常采用Swiss-Model、Phyre2 等分析工具，ExPASy、BLAST 在線網(wǎng)站可以對(duì)跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。在對(duì)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析的研究上，朱曉林等[32]對(duì)Ty-6基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，利用xPASy-ProtParam tool進(jìn)行蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，用SOPMA 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，用SWISSMODEL 平臺(tái)進(jìn)行蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，用MHMM Server v.2.0 平臺(tái)對(duì)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析等。楊欣蓉等[33]對(duì)菠蘿蜜BRI1 家族成員利用預(yù)測(cè)網(wǎng)站SOPMA 和SWISS-MODEL 分析網(wǎng)站對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。

同時(shí)，生物信息學(xué)的發(fā)展也催生了一種新的基因克隆方法——電子克?。↖n silico cloning）。它是通過(guò)生物信息學(xué)手段電子延伸獲得目的基因的全長(zhǎng)。大致過(guò)程是通過(guò)轉(zhuǎn)錄本庫(kù)、基因庫(kù)等不完整序列確定目的片段部分序列，再進(jìn)行電子延伸以獲得目的序列片段，最后進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，獲得目的序列準(zhǔn)確信息的過(guò)程[34]。在植物基因克隆方面最新報(bào)道有，采用電子克隆技術(shù)對(duì)木薯MeZnT11基因進(jìn)行擴(kuò)增[35]，通過(guò)建立新的電子克隆方法對(duì)芒果LAR基因進(jìn)行克隆[36]。甜菜基因電子克隆研究則較少，曾利用電子克隆技術(shù)對(duì)甜菜BvM14-glyoxalase I基因[37]和BvLRR-RPK2;1基因[38]進(jìn)行了克隆。

3 載體的構(gòu)建

在獲得目的片段之后，我們需要將其連接在載體上，使其能夠自主復(fù)制并導(dǎo)入寄主細(xì)胞，從而滿足后續(xù)研究的要求。該步驟即為載體的構(gòu)建。按不同來(lái)源劃分，載體可分為質(zhì)粒載體[39]、噬菌體載體、粘粒載體[40-41]、病毒載體[42]和人工染色體載體[43-45]等。按不同用途劃分，載體可分為克隆載體和表達(dá)載體。

3.1 不同來(lái)源的載體類型

質(zhì)粒載體是指能夠連接目的基因進(jìn)行自我復(fù)制的小型環(huán)狀DNA 分子。從第一個(gè)質(zhì)粒載體pSC101 于1973 由Cohen 等構(gòu)建，越來(lái)越多的新型質(zhì)粒被挖掘[46]。到目前為止，創(chuàng)建了有史以來(lái)最小的質(zhì)粒載體pI‐COz[47]，開(kāi)發(fā)了兩種耐藥的質(zhì)粒載體pBS2ndd和pBS3ndd來(lái)提高細(xì)菌宿主細(xì)胞大腸桿菌DNA 片段分子克隆的效率[48]。噬菌體由于克隆效率高、容量大等優(yōu)勢(shì)，也常常用作載體，常用的噬菌體有λ 噬菌體載體和M13 噬菌體[49]。近年來(lái)，利用一種ssRNA 噬菌體LeviOr01，可在銅綠假單胞菌中建立起載體狀態(tài)[50]。人工染色體是指能夠?qū)Υ笃蜠NA 進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制子，人工染色體的構(gòu)建則是從1983年第一個(gè)酵母人工染色體（YAC）載體的構(gòu)建到第一個(gè)細(xì)菌人工染色體（BAC）載體和雙元細(xì)菌人工染色體（BIBAC）的出現(xiàn)，人工染色體載體的容載和轉(zhuǎn)化能力不斷增強(qiáng)，在生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的越來(lái)越多[43-45]。目前，已經(jīng)可使用容載能力更強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)充分的人類人工染色體（HAC）載體作為文庫(kù)構(gòu)建與基因克隆的工具[51]。

3.2 不同用途的載體類型

克隆載體是指能夠與外源DNA片段重組，轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞可被快速擴(kuò)增，且具有篩選標(biāo)記的DNA分子，用于使目的基因能在受體細(xì)胞中得到復(fù)制，從而便于保存與操作。常用于外源基因克隆的載體有噬菌體或質(zhì)粒[52]。隨著對(duì)質(zhì)粒研究的不斷深入，克隆載體的種類和數(shù)量越來(lái)越多，日益成為基因工程技術(shù)的重要內(nèi)容[53]。表達(dá)載體的功能是使目的基因在受體生物體內(nèi)表達(dá)，從而獲得其編碼產(chǎn)物，進(jìn)而分析其功能與作用機(jī)制，包括蛋白質(zhì)基本結(jié)構(gòu)、生理功能、調(diào)控機(jī)制等。表達(dá)載體除了要求與克隆載體一樣擁有復(fù)制的起始、終止位點(diǎn)及有關(guān)復(fù)制的調(diào)控序列之外，還需要具有啟動(dòng)子、終止子等與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的調(diào)控序列，保證目的基因能高效地表達(dá)。選用細(xì)菌質(zhì)粒進(jìn)行載體構(gòu)建時(shí)，除具備克隆載體的標(biāo)記基因外，載體還需要使所攜帶的片段可被識(shí)別，以檢驗(yàn)片段是否成功整合到染色體DNA中，該功能可由篩選標(biāo)記基因或表達(dá)報(bào)告基因來(lái)實(shí)現(xiàn)[54]。

3.3 載體構(gòu)建基本過(guò)程

載體構(gòu)建的常規(guī)過(guò)程是通過(guò)酶切與連接完成，克隆載體還可通過(guò)T-A 克隆方案實(shí)現(xiàn)，雖然以上技術(shù)路線已比較成熟，但載體構(gòu)建技術(shù)仍然在逐步發(fā)展之中。2007年，Gateway 技術(shù)作為克隆載體構(gòu)建技術(shù)獲得了成功[55]，之后，利用重疊延伸PCR 技術(shù)，構(gòu)建了帶有潮霉素B 抗性基因作為選擇性標(biāo)記的單交換載體pBShygro[56]，也進(jìn)行了紅球菌-大腸桿菌穿梭載體的構(gòu)建[57]。

重組載體導(dǎo)入寄主細(xì)胞的方法比較成熟，近年來(lái)未見(jiàn)更新，但在此后的重組克隆/重組個(gè)體篩選方面，方法一直比較多樣，且經(jīng)常根據(jù)具體研究?jī)?nèi)容演化出適合的改良方法。例如，當(dāng)用噬菌體DNA 作為載體導(dǎo)入到寄主細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)后理論上不需要篩選，所有正常的噬菌斑都是重組體；當(dāng)使用pUC 系列載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，可用經(jīng)典的藍(lán)白斑篩選法，出現(xiàn)的白色菌落一般都是重組體；如果質(zhì)粒沒(méi)有明顯的特性，那么也可以采用DNA 酶切分析方法進(jìn)行直接鑒定[58-59]。比較復(fù)雜的核酸雜交、免疫化學(xué)等方法也曾經(jīng)被用于轉(zhuǎn)化子篩選。在核酸雜交技術(shù)的應(yīng)用方面，利用RNAscope 技術(shù)對(duì)植物組織中的病毒核酸進(jìn)行雙原位雜交，從而對(duì)其進(jìn)行特異性和敏感性分析[60]；利用熒光原位雜交技術(shù)，使用核酸探針檢測(cè)目標(biāo)微生物[61]。在免疫化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用方面，已對(duì)危險(xiǎn)污染物喹氧靈進(jìn)行了免疫化學(xué)快速測(cè)定，并首次制備了喹氧靈的免疫試劑，提供了利用免疫化學(xué)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化子及其蛋白質(zhì)的新思路[62]。

4 甜菜基因克隆相關(guān)研究現(xiàn)狀

4.1 國(guó)外甜菜基因克隆相關(guān)研究進(jìn)展

國(guó)外甜菜基因克隆研究略領(lǐng)先于我國(guó)，性狀上更有針對(duì)性，且研究連貫性更明顯，能較快地完成對(duì)影響甜菜生長(zhǎng)因子的克隆、分析及鑒定，直接面向生產(chǎn)問(wèn)題，理論研究方面也相對(duì)深入。例如：GINDULLIS等[63]建立甜菜細(xì)菌人工染色體（BAC）庫(kù)，為甜菜基因組分析提供了途徑。之后，對(duì)甜菜細(xì)菌人工染色體中不同類型基因克隆的研究也開(kāi)展起來(lái)[64]。MATSUHIRA 等[65]通過(guò)對(duì)甜菜新型生育恢復(fù)因子（Rf）進(jìn)行克隆和轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建，從而對(duì)其進(jìn)行特征分析。DUNAJSKA-ORDAK 等[66]對(duì)從受鹽脅迫的甜菜植物葉片中分離出來(lái)的全長(zhǎng)cdna 編碼過(guò)氧化物酶BvpAPX 進(jìn)行了克隆與表達(dá)分析。LAUFER 等[67]對(duì)甜菜土傳花葉病毒和甜菜壞死黃脈病毒cDNA 克隆體外等溫重組，構(gòu)建含有兩種病毒所有基因組的載體，并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性觀察和分析。LI等[68]對(duì)甜菜根蛆基因調(diào)控的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，對(duì)SBRM基因在發(fā)育、調(diào)控、細(xì)胞過(guò)程、信號(hào)傳導(dǎo)和應(yīng)激條件下的功能進(jìn)行了注釋。SAMUELIAN 等[69]通過(guò)cDNA-AFLP、Real-time PCR 等技術(shù)對(duì)甜菜胞囊線蟲(chóng)感染表達(dá)上調(diào)基因進(jìn)行克隆及功能分析，進(jìn)而闡明其抗甜菜囊狀線蟲(chóng)的作用，表明該基因可用于誘導(dǎo)植物的囊線蟲(chóng)抗性。PIERGIORGIO 等[70]對(duì)甜菜抗線蟲(chóng)基因HsBvm-1進(jìn)行SNP標(biāo)記的鑒定和驗(yàn)證，確定了與一個(gè)甜菜耐線蟲(chóng)性完全相關(guān)的標(biāo)記（SNP192）?？芍?，國(guó)外對(duì)甜菜基因克隆研究大部分處于基因的表達(dá)模式和基因與性狀的關(guān)系和分子機(jī)制兩個(gè)層面上。MINIC 等[71]通過(guò)半定量RT-PCR、原位雜交和啟動(dòng)子-GUS 融合等技術(shù)對(duì)擬南芥中一個(gè)種子特異的阿拉伯多糖水解酶進(jìn)行純化、功能表征、克隆和突變體的鑒定。對(duì)擬南芥多糖水解的研究也有希望對(duì)將來(lái)甜菜多糖代謝的研究奠定有利的基礎(chǔ)。

4.2 我國(guó)甜菜基因克隆相關(guān)研究進(jìn)展

我國(guó)甜菜基因資源目前還相當(dāng)缺乏，基因資源收集和序列分析的工作剛剛起步，此前的克隆方法以無(wú)參考序列的PCR技術(shù)為主。丁廣洲等[72]通過(guò)RACE技術(shù)對(duì)nia基因進(jìn)行克隆，揭示氮元素對(duì)nia基因的影響。張永豐[73]從豐產(chǎn)型甜菜品種中克隆出兩個(gè)BvDof基因轉(zhuǎn)入擬南芥中進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)甜菜塊根生長(zhǎng)速率與Dof轉(zhuǎn)錄因子家族基因的表達(dá)水平相關(guān)。曹國(guó)麗[74]對(duì)與甜菜塊根發(fā)育相關(guān)的ERF基因及BvCPD進(jìn)行了克隆，分析表明15 個(gè)家族成員與甜菜塊根轉(zhuǎn)入快速生長(zhǎng)階段有關(guān)。焦琦[75]通過(guò)克隆液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BvNHX基因?qū)μ鸩四望}堿化程度進(jìn)行分析。李寧寧等[76]采用同源克隆、qRT-PCR等技術(shù)和分析軟件對(duì)甜菜液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BvNHX1基因進(jìn)行了克隆和生物信息學(xué)分析。王宇光等[77-78]]利用5'-/3'-race法等技術(shù)對(duì)甜菜M14中提高植物耐鹽性的胱抑素基因進(jìn)行克??；并對(duì)甜菜BvBHLH92基因進(jìn)行序列分析，甜菜響應(yīng)鹽脅迫的組織表達(dá)分析，亞細(xì)胞定位等。呂笑言等[79]利用PCR反應(yīng)、RT-PCR等技術(shù)對(duì)甜菜基因BvM14-CMO、BvM14-BADH進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，以及鹽脅迫下的表達(dá)分析。李國(guó)龍等[80]以干旱處理的強(qiáng)抗旱甜菜品種HI0466為材料，通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆到一個(gè)甜菜與抗旱相關(guān)的NAC類轉(zhuǎn)錄因子基因的cDNA序列，進(jìn)行了序列分析和植物表達(dá)載體的構(gòu)建。張皓等[81]對(duì)甜菜抗逆基因P5CS進(jìn)行了克隆和鹽脅迫下的表達(dá)分析。徐曉陽(yáng)[82]利用RNA-seq、qRT-PCR等技術(shù)對(duì)甜菜抗旱性相關(guān)的AC轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行克隆，表達(dá)分析及功能鑒定。王錦霞等[83]通過(guò)RT-PCR 方法，獲得基因的全長(zhǎng)序列，對(duì)甜菜重金屬脅迫應(yīng)答B(yǎng)vMTP11基因進(jìn)行克隆及序列分析。魯振強(qiáng)等[84]通過(guò)RT-PCR技術(shù)，對(duì)甜菜抗草甘膦除草劑AtEPSPs基因的功能域進(jìn)行了克隆。JIANG等[85]對(duì)甜菜壞死黃脈病毒進(jìn)行載體的開(kāi)發(fā)，并將應(yīng)用于基因組研究和多種蛋白質(zhì)在甜菜和相關(guān)作物中的表達(dá)。李夢(mèng)林等[86]對(duì)甜菜神秘病毒BCV基因組進(jìn)行克隆和序列分析。喬芬[87]利用第二代測(cè)序技術(shù)、qRT-PCR技術(shù)、體外RNAi技術(shù)對(duì)甜菜抗線蟲(chóng)Hs1-2基因進(jìn)行序列查找和生物信息學(xué)分析，選出抗孢囊線蟲(chóng)候選基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。魯振強(qiáng)等[88]采用同源克隆和RACE等方法對(duì)甜菜與生殖相關(guān)的BvMARB基因進(jìn)行了克隆。烏日漢[89]利用同源序列克隆、半定量PCR技術(shù)、qRT-PCR技術(shù)對(duì)甜菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因進(jìn)行了克隆和生物信息學(xué)分析，以及在花蕾中相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行了分析。劉洪偉等[90]利用RACE-PCR技術(shù)對(duì)甜菜赤霉素合成途徑中的樹(shù)貝殼杉烯合酶基因進(jìn)行了克隆和生物信息學(xué)分析。王飛等[91]也采用同源克隆技術(shù)和相關(guān)軟件對(duì)甜菜素合成相關(guān)基因BvDDC1進(jìn)行了克隆和分析。馬冰雪等[92]對(duì)紅甜菜UGT、TYR等基因進(jìn)行了克隆并對(duì)不同光質(zhì)對(duì)甜菜色素含量的影響進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。

通過(guò)以上論述不難發(fā)現(xiàn)，我國(guó)基因克隆研究近年不斷增多，技術(shù)在不斷更新，對(duì)甜菜基因結(jié)構(gòu)和功能有了一定程度的了解。甜菜基因克隆研究主要處于序列的獲取和結(jié)構(gòu)分析及基因的表達(dá)模式兩個(gè)層面上，在基因與性狀的關(guān)系和分子機(jī)制方面的分析幾乎沒(méi)有。筆者認(rèn)為甜菜基因資源并不夠豐富，并且在對(duì)甜菜基因表達(dá)模式及其生物學(xué)功能上的研究幾乎為空白，而獲取基因資源則是這一切的前提，所以甜菜下一步研究應(yīng)繼續(xù)集中在甜菜基因資源收集方面，同時(shí)使用生物信息學(xué)分析對(duì)甜菜基因序列的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析，可以為今后試驗(yàn)提供研究材料，并為將來(lái)田間實(shí)際應(yīng)用做準(zhǔn)備。

5 討論

5.1 基因克隆的意義

基因克隆是一切關(guān)于基因功能、調(diào)控機(jī)制等理論研究的必要前提，也是針對(duì)特定基因開(kāi)展遺傳改良工作的必要前提。為了使植物的應(yīng)用符合人類的需求，開(kāi)發(fā)更多植物潛在的使用功能，這要求我們對(duì)植物基因的序列、表達(dá)及作用機(jī)制有更多的了解和掌握。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因克隆技術(shù)也不斷在創(chuàng)新，生物信息學(xué)分析的手段越來(lái)越多元化，我們對(duì)植物基因序列的結(jié)構(gòu)和功能的了解也越來(lái)越多。我們可以通過(guò)基因克隆技術(shù)了解植物基因的序列，對(duì)比序列了解其大概的功能關(guān)系，通過(guò)構(gòu)建載體進(jìn)行表達(dá)分析，確定某基因行使的功能，通過(guò)多次試驗(yàn)使其能在性狀改良乃至產(chǎn)業(yè)發(fā)展中進(jìn)行應(yīng)用。

5.2 甜菜基因克隆目前存在的問(wèn)題

在基因克隆研究的過(guò)程中，基因序列的信息越缺乏，基因克隆工作也會(huì)耗時(shí)越長(zhǎng)、操作越繁瑣。并且基因資源越缺乏，新基因資源的尋找難度越大。對(duì)于甜菜而言，基因克隆研究主要面臨的問(wèn)題有：（1）資源與序列信息均嚴(yán)重缺乏，甜菜序列信息不足、質(zhì)量較低、更新偏慢；（2）基因克隆使用的方法陳舊，導(dǎo)致甜菜基因挖掘與克隆的效率不高；（3）生物信息學(xué)分析的手段不多，分析經(jīng)驗(yàn)也比較缺乏，無(wú)法更深層次地了解和預(yù)測(cè)基因的結(jié)構(gòu)和功能。盡管模式植物已經(jīng)從基因資源挖掘時(shí)代轉(zhuǎn)入了基因調(diào)控機(jī)制研究時(shí)代，但在針對(duì)甜菜的研究中，獲得充足、可靠、有價(jià)值的基因資源仍然是現(xiàn)階段的首要任務(wù)。所幸在現(xiàn)階段序列信息不斷增長(zhǎng)、測(cè)序成本不斷下降的大形勢(shì)下，我們可以借助序列分析與序列收集，加速甜菜基因克隆與早期分析的進(jìn)程，因此筆者預(yù)測(cè)，甜菜的基因克隆雖然起步晚于主糧作物和模式植物，但其發(fā)展速度將比其它作物的起步階段更加迅速，與基因功能深入分析的對(duì)接也有希望更加順暢。

5.3 甜菜基因克隆未來(lái)研究方向

不論是基因資源的獲取，還是后續(xù)的理論或應(yīng)用研究，我們目前進(jìn)行的植物基因克隆并不算完成，基因克隆僅僅是基礎(chǔ)性的工作，僅僅是為未來(lái)解決實(shí)際問(wèn)題提供必要的材料。因此，基因資源獲取得到一定程度的實(shí)現(xiàn)以后，研究方向?qū)⒅饕性趯?duì)目的基因序列進(jìn)行功能分析，主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：（1）通過(guò)微生物表達(dá)系統(tǒng)去制備基因產(chǎn)物，分析這些蛋白質(zhì)本身的功能；（2）通過(guò)在植物中的表達(dá)去分析基因?qū)χ参镄誀畹挠绊?，以及基因產(chǎn)物在代謝通路中的作用及相關(guān)的調(diào)控機(jī)制，直至對(duì)基因產(chǎn)物，從結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控等多方面完成一定程度的分析，獲得比較確切的注釋。

不論何種形式與技術(shù)路線的基因克隆工作，最終都是以實(shí)際應(yīng)用到種植和生產(chǎn)實(shí)踐為目的，用來(lái)提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。在甜菜的具體研究中，也要根據(jù)研究目的，有針對(duì)性地進(jìn)行方案設(shè)計(jì)。針對(duì)抗逆性、抗病性、抗抽薹性等由少數(shù)基因控制的性狀，只要找到其中的關(guān)鍵基因，并將其導(dǎo)入目標(biāo)種質(zhì)中，或者以基因?yàn)槟繕?biāo)進(jìn)行種質(zhì)的篩選，即有希望獲得性狀得到改良的種質(zhì)；而針對(duì)產(chǎn)量、含糖率、形態(tài)結(jié)構(gòu)、發(fā)育習(xí)性等由多基因控制或調(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜的性狀，則需要由關(guān)鍵基因入手，先對(duì)基因起作用的分子機(jī)制、與性狀表現(xiàn)相關(guān)的代謝通路等展開(kāi)基礎(chǔ)理論研究，再針對(duì)具體的代謝機(jī)理，設(shè)計(jì)遺傳改良方案，最終將基因應(yīng)用于相應(yīng)性狀的改良。