王美玲 劉華緒

山東第一醫(yī)科大學附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病醫(yī)院，山東省皮膚病性病防治研究所)，濟南，250022

血管是維持組織細胞生長發(fā)育、新陳代謝、運輸氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)等功能所必須的，血管生成在組織細胞的生長發(fā)育和機體的某些疾病中都有著重要作用：胚胎時期參與胚胎的發(fā)育成熟；病理情況下參與傷口愈合、免疫、炎癥反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生以及進展等過程。其過程涉及許多種信號通路，如PI3K/AKT/mTOR、VEGF-VEGFR、PDGF/PDGFR-β、HIF、Notch等。

1 血管生成的組織胚胎學基礎(chǔ)

胚胎時期的血管發(fā)育稱為血管發(fā)生(vasculogenesis)，是由起源于胚胎卵黃囊的中胚層細胞——內(nèi)皮祖細胞(EPCs，也稱血管母細胞)逐漸分化成為內(nèi)皮細胞(ECs)并形成原始血管腔[1]。血管生成(angiogenesis)是指從已有的血管系統(tǒng)中長出新的血管。其過程包含：來自其周圍細胞的血管生成信號導(dǎo)致血管擴張和血管通透性增加；膠原酶和基質(zhì)金屬蛋白酶等消化酶使基底膜發(fā)生降解；血漿蛋白隨后形成富含纖維蛋白的基質(zhì)；活化的內(nèi)皮細胞移向該部位，并開始增殖，在增生的毛細血管中形成管腔[2]。最終，在剪切應(yīng)力的作用下，新形成的毛細血管成為現(xiàn)有循環(huán)的一部分。這個過程與很多復(fù)雜的分子機制有關(guān)[3]。

血管系統(tǒng)的生成主要包括血管芽的形成、尖端細胞(tip cell)的選擇、尖端細胞遷移、莖細胞(stalk cells)的增殖以及血管周細胞或血管平滑肌細胞等的共同作用，最終形成穩(wěn)定的管腔。尖端細胞是由現(xiàn)存的內(nèi)皮細胞分化發(fā)展而來，其后方具有增殖和延長血管網(wǎng)能力并形成管腔樣結(jié)構(gòu)的內(nèi)皮細胞稱為莖細胞。尖端細胞具有運動性，侵襲性和高度極化的特點，其絲狀突起可以伸展并引導(dǎo)內(nèi)皮細胞的生長[4]。隨著尖端細胞的遷移和莖細胞的增殖，形成管腔和構(gòu)建血液循環(huán)。尖端細胞和莖細胞的生成過程受到血管內(nèi)皮生長因子(VEGFs)/Notch等信號通路的調(diào)節(jié)[5]。

2 Notch信號通路

2.1 Notch信號通路概述 1917年有學者首先發(fā)現(xiàn)Notch基因的存在。Notch受體、Notch配體和CSL-DNA結(jié)合蛋白是Notch信號通路可發(fā)揮生物學作用的三個結(jié)構(gòu)域組成。目前已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)四種受體(即Notch1、Notch2、Notch3和Notch4)和五種配體(即jagged1、jagged2和DLL1、DLL3 DLL4)。Notch配體的DSL(Delta/Serrate/Lag2)區(qū)域與受體的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域結(jié)合并通過激活下游的一系列反應(yīng)而產(chǎn)生生物學效應(yīng)[6]。

Notch信號通路的受體和配體的效應(yīng)機制都是單次跨膜蛋白，通過細胞之間的直接接觸而觸發(fā)信號級聯(lián)反應(yīng)，進而參與多種生理病理過程。當屬于特定細胞的Notch(跨膜受體)與屬于其鄰近細胞的Delta或Jagged(跨膜配體)相互作用時，能激活Notch細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)[7]。NICD隨后進入細胞核并調(diào)節(jié)Notch通路下游許多靶基因的表達，盡管產(chǎn)生了相同的信號(NICD)，但通過Delta激活的Notch-Delta(N-D)信號和通過Jagged激活的和Notch-Jagged(N-J)信號具有不同的動力學效應(yīng)。因為NICD不對稱地調(diào)節(jié)兩個配體的表達：它能抑制Delta的表達，卻相反地激活了Jagged，Notch-Delta可以形成一個細胞信號間的雙負反饋環(huán)，相反，Notch-Jagged信號產(chǎn)生一個細胞間雙正反饋環(huán)。除NICD的不對稱調(diào)節(jié)外，N-D和N-J信號也可通過糖基轉(zhuǎn)移酶進行差異調(diào)節(jié)。這些機制最終導(dǎo)致它們在血管生成過程中發(fā)揮互補作用[8]。

2.2 Notch信號通路與血管生成 Notch信號通路能通過參與尖端細胞/莖細胞、動靜脈的選擇、內(nèi)皮細胞的增殖以及細胞間相互作用和維持血管穩(wěn)定性等過程來調(diào)控血管的發(fā)育[9]。通過對小鼠Notch信號相關(guān)基因靶向缺失的研究發(fā)現(xiàn)，該小鼠表現(xiàn)出多種血管障礙，主要影響血管重塑和動脈形成的過程。Notch1、DLL4和CSL突變導(dǎo)致最嚴重的血管破裂。僅Notch4基因突變的小鼠血管發(fā)育未受影響；而Notch1/Notch4雙突變體的小鼠卻顯示出血管缺陷，比僅缺乏Notch1的小鼠出現(xiàn)的更加嚴重，這表明Notch1/Notch4的功能是有重疊的。Jagged1缺失也會導(dǎo)致出血和血管生成重建失敗而導(dǎo)致死亡，此外，DLL4雜合子缺失也是致命的。DLL4突變體中的血管缺陷包括動靜脈畸形、缺乏血管重塑和大動脈塌陷或形成不完全。另外，在斑馬魚實驗中，Delta-Notch信號對動脈內(nèi)皮細胞的分化和大動脈的正常形成也具有重要作用[10]。上述研究說明notch通路在血管發(fā)育成熟過程中的作用都是不可缺失的。

3 VEGF概述

3.1 VEGF家族 VEGF包括VEGF-A(是在組織中最常表達的類型)、VEGF-(B、C、D、E、F)和胎盤生長因子(PlGF)。VEGF-A參與了血管生成的調(diào)控，本文也主要闡述其在血管生成中的作用[11]。VEGF與其受體血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)相結(jié)合而發(fā)揮作用，主要包括VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3。VEGF-A的受體主要是VEGFR-1、2，VEGFR-1、2主要在內(nèi)皮細胞中表達。VEGFR是酪氨酸激酶，在配體二聚作用下自磷酸化，活化后激活下游多種信號。驅(qū)動內(nèi)皮細胞產(chǎn)生多種細胞效應(yīng)，如遷移、增殖、細胞存活和調(diào)控下游基因的表達[12]。

3.2 VEGF與血管生成 在血管系統(tǒng)發(fā)育的過程中，VEGFA主要與VEGFR2相結(jié)合來調(diào)節(jié)ECs的遷移、增殖和募集等過程，對于促進血管生成非要重要，當細胞組織接受VEGF的刺激后，ECs產(chǎn)生偽足并向頂端細胞延伸，此時，莖細胞則緊隨其后不斷增殖和延長，最終共同作用并成為新生血管的主干[13]。通過小鼠的基因靶向研究強調(diào)了血管內(nèi)皮生長因子途徑在血液和淋巴血管系統(tǒng)發(fā)育中的重要性。VEGF-A或其主要信號受體VEGF-R2的基因缺失導(dǎo)致早期胚胎因為造血和血管發(fā)育的幾乎完全阻斷而死亡(大約胚胎第9天)。類似地，VEGF-C的缺陷導(dǎo)致淋巴管的發(fā)育嚴重阻塞，VEGF-C的主要受體VEGF-R3的缺失導(dǎo)致與血管缺陷相關(guān)的胚胎死亡。VEGF-R1的缺失也會導(dǎo)致胚胎死亡，而其他VEGF配體的缺失不是致命的，對斑馬魚的研究也揭示了VEGF在血管系統(tǒng)中的相同作用[10]。

3.3 VEGF與血管生成相關(guān)疾病的關(guān)系 VEGF在血管生成中的作用是十分重要的，而各種腫瘤的產(chǎn)生也需要血管生成才能提供足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)來維持其發(fā)生發(fā)展，所以VEGF作為抗血管生成靶點的抑制劑已成為抗腫瘤治療的方式之一。2004年，VEGF的單抗貝伐單抗(Bevacizumab)作為靶向抗血管治療藥物由FDA批準上市，隨后還批準了索拉非尼(Sorafenib)和舒尼替尼(Sunitinib)上市?？捎糜谀I細胞癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌等多種癌癥的治療[14]。 此外，通過對在嬰幼兒血管瘤組織的研究發(fā)現(xiàn)，在增殖期、消退期等不同時期其組織內(nèi)的VEGF與Notch信號和缺氧之間是相互影響和調(diào)控的[15]。在鮮紅斑痣激光治療后血管再生的機制研究中，也發(fā)現(xiàn)VEGF與下游PI3/K/AKT/mTOR/P70S6K和SHC1/MEK/ERK途徑的級聯(lián)反應(yīng)是密切相關(guān)的，可以通過抑制VEGF信號來調(diào)節(jié)鮮紅斑痣激光治療后引起的血管再生[16]。另外，老年性黃斑變性、高血壓、冠心病等多種疾病都與VEGF相關(guān)。

4 缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)概述

HIF是對細胞缺氧進行調(diào)節(jié)的重要基因。HIF最早是1992年被發(fā)現(xiàn)的，HIF家族主要有HIF-1、2、3三種亞型。主要是α和β兩個亞基組成, α亞基主要調(diào)節(jié)其活性；β亞基則主要負責穩(wěn)定性。HIF-1α是目前已知的缺氧信號的主要調(diào)控基因。HIF-1α廣泛表達于幾乎所有的先天性和適應(yīng)性免疫群體，HIF-2α在多種細胞類型中都有表達，如：內(nèi)皮細胞和某些免疫細胞[17]。

HIF-1α通過充當氧傳感器的脯氨酸羥化酶在特定脯氨酸殘基上羥基化；也可通過E3/pVHL泛素連接酶而被泛素化。在常氧情況下，快速泛素化和26S蛋白酶體降解會導(dǎo)致HIF-1α的穩(wěn)定性降低。在缺氧情況下，HIF-1α水平升高是泛素化減少和蛋白酶體介導(dǎo)降解減少的結(jié)果。在典型的缺氧反應(yīng)中，缺氧通過改變HIF-1α的活性和穩(wěn)定性而發(fā)揮作用，穩(wěn)定的HIF-1α與HIF-1β(也稱為ARNT)相結(jié)合，再與一些效應(yīng)基因的特異性缺氧反應(yīng)元件(HRE)相作用，激活其下游的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、促紅細胞生成素和磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、PAI-1、轉(zhuǎn)鐵蛋白和促紅細胞生成素等基因，參與血管生成和葡萄糖代謝等過程[18]。典型的缺氧反應(yīng)也能將缺氧信息傳遞并激活Notch信號通路，從而啟動其下游的一系列反應(yīng)。

5 HIF-VEGF-Notch信號通路在血管生成中的相互作用及其機制

在腫瘤發(fā)生發(fā)展、傷口的愈合、炎癥反應(yīng)等過程中，都會有血管生成的參與。血管生成也是機體防御反應(yīng)的一部分，其過程涉及許多種分子機制， 而VEGF、HIF-1α以及Notch信號通路之間能通過相互調(diào)控作用共同影響血管生成。

5.1 VEGF與HIF HIF-1α作為氧濃度的關(guān)鍵分子，在缺氧反應(yīng)中受到多水平的調(diào)節(jié)。許多研究表明，HIF-1α mRNA在嚙齒動物和人類的缺氧或缺血反應(yīng)中增加。此外，HIF-1α mRNA的穩(wěn)定也可能有助于其自身mRNA的持續(xù)增加。在典型的缺氧反應(yīng)中， HIF-1α的活性和穩(wěn)定性發(fā)生改變，導(dǎo)致HIF-1α與特定靶基因中含有的相應(yīng)調(diào)節(jié)因子結(jié)合，激活下游多種基因，發(fā)生信號級聯(lián)反應(yīng)。缺氧激活的HIF-1α可以轉(zhuǎn)運到細胞核中，直接與下游靶基因VEGF啟動子的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合并使其轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致VEGF信使RNA(mRNA)水平的增加[19]。

5.2 VEGF和DLL4/Notch信號在尖端細胞(內(nèi)皮細胞)中的作用 DLL4作為Notch信號的配體之一，主要表達于內(nèi)皮細胞，是血管生成的調(diào)控因子之一并具有重要作用。當血管生成發(fā)生時， DLL4主要表達于血管出芽最前端的尖端細胞，此外，在內(nèi)皮細胞、莖細胞和毛細血管等也有表達。它與VEGF一起相互作用共同調(diào)控莖細胞與尖端細胞的分化、遷移和增殖等過程。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF-A)在血管生成和功能調(diào)節(jié)過程中都十分重要[20]。主要通過引導(dǎo)血管尖端細胞的延伸來參與血管生成[21]。

對培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞的研究揭示了VEGF和DLL4-Notch通路可相互作用并調(diào)節(jié)血管生成。VEGF作為DLL4上游的信號調(diào)節(jié)因子，能增加DLL4的表達。用VEGF刺激培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞會導(dǎo)致DLL4 mRNA和蛋白質(zhì)的表達增加。研究表明Notch信號在VEGF-A的刺激下誘發(fā)ECs的側(cè)向抑制，導(dǎo)致ECs不均勻分布。此時莖細胞受到增強的Notch信號傳導(dǎo)，抑制VEGFR2的轉(zhuǎn)錄，同時刺激可溶性受體VEGFR1(sVEGFR1)的表達。而尖端細胞接收到的信號，則允許表達高VEGFR2和低sVEGFR1[13]。另外，有研究表明DLL4實際上是通過上調(diào)VEGFR1，而下調(diào)VEGFR2產(chǎn)生作用，其中VEGFR1的激活可以抑制血管ECs的增殖，而VEGFR2的激活則會促進血管生成[22]。即可以總結(jié)為VEGF是DLL4-Notch信號通路的正向調(diào)控基因，而DLL4-Notch信號通路對VEGF具有負反饋調(diào)控作用[23]。在內(nèi)皮細胞中， DLL4/Notch信號的主要作用是抑制內(nèi)皮細胞增殖、遷移和發(fā)芽。DLL4/Notch信號被阻斷后會引發(fā)內(nèi)皮細胞的過度增殖，尖端細胞增多，最終導(dǎo)致血管生成不完全和血管灌注不良等[24]。

VEGF和DLL4/Notch信號的相互調(diào)控能避免形成過多的無功能血管，并且能誘導(dǎo)血管形成正常且功能成熟和管腔化完整，進而使得血管系統(tǒng)可以根據(jù)環(huán)境的變化需求來適時形成血管，這些作用對于機體是否能形成有完整功能的血管網(wǎng)是必要的。當這種平衡調(diào)節(jié)被打破后，就會導(dǎo)致形成無功能的血管、血管滲漏或者血管生成過度。

5.3 HIF-VEGF-DLL4信號的相互調(diào)控 VEGF是一個典型的缺氧反應(yīng)基因，且能與HIF基因相互作用，促進彼此的表達。在缺氧區(qū)，HIF-1α在ECs中上調(diào)，導(dǎo)致VEGF-A分泌增強。VEGF-A刺激內(nèi)皮細胞表達Notch配體DLL4。另外，缺氧時可誘導(dǎo)HIF-1α與Notch互相作用。此時Notch前體在沒有活性的狀態(tài)下被類似于Furin轉(zhuǎn)化酶水解并轉(zhuǎn)移到細胞中，與Notch配體結(jié)合，通過一系列的酶解反應(yīng)激活NICD。當NICD激活后，CSL成為一個轉(zhuǎn)錄激活因子來進一步激活下游基因，使其開始轉(zhuǎn)錄。在NICD沒有活化的情況下，CSL轉(zhuǎn)錄因子抑制Notch靶基因的轉(zhuǎn)錄。缺氧時產(chǎn)生的HIF-1α也可通過直接影響NICD的活性來增強Notch信號的表達[13]。

由缺氧引起的NICD激活，是通過缺氧對NICD穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)和 NICD-CSL相互作用完成的，而不是由HIF-1α與其DNA的直接作用。HIF-1α是一個高度Notch特異性啟動子，包含CSL結(jié)合位點，能在缺氧條件下被強烈激活[18]。

總之，在缺氧的情況下，經(jīng)過VEGF的誘導(dǎo)，DLL4的激活可以間接發(fā)生。而且缺氧可引起DLL4表達直接上調(diào)，HIF-1α通過與DLL4啟動子中的缺氧反應(yīng)元件和相結(jié)合而產(chǎn)生作用，來增加機體組織對缺氧的反應(yīng)[25]。此外，已有研究表明，DLL4是一個缺氧調(diào)節(jié)因子，它不僅在ECs中接收HIF-1a信號，而且能通過缺氧途徑對HIF-1a-VEGF信號作出反應(yīng)[26，27]。

5.4 Jagged-Notch信號通路與血管生成 目前有研究結(jié)果表明，DLL4與Jagged1對血管出芽的調(diào)控作用是相反的。DLL4在毛細血管和動脈的內(nèi)皮細胞中表達，而Jagged1在內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞(vSMCs)中均表達。由于DLL4通過Notch1信號傳導(dǎo)阻斷內(nèi)皮細胞活化，同時也誘導(dǎo)Jagged1的表達。然后Jagged1通過Notch1阻斷DLL4信號，通過血管內(nèi)皮生長因子激活內(nèi)皮細胞[28]。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞Jagged1的過度表達提高了真皮傷口的愈合率，并與新生血管的密度、成熟度和功能性增加有關(guān)，而內(nèi)皮細胞特異性Jagged1基因敲除產(chǎn)生的作用則相反。除拮抗DLL4導(dǎo)致的Notch信號激活外，Jagged1還可以通過直接向tip細胞發(fā)送信號調(diào)節(jié)VEGF受體3(VEGFR3)的表達來促進血管生成。VEGFR3在介導(dǎo)淋巴管生長中起著重要作用，但它也在促進血管生成的內(nèi)皮尖端細胞中表達[29]。因此，我們可以設(shè)想，正如DLL4-Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下調(diào)莖細胞VEGF受體的表達以抑制血管生長一樣，Jagged1-Notch信號可轉(zhuǎn)導(dǎo)尖端細胞VEGFR3的表達以促進血管生長。Jagged在Stalk細胞中高表達，而DLL4則主要在Tip細胞中表達，糖基轉(zhuǎn)移酶Fringe可以介導(dǎo)Jagged1和DLL4在內(nèi)皮細胞中的相互拮抗作用，F(xiàn)ringe能以配體依賴的方式調(diào)控Notch受體的翻譯后修飾。因此，Jagged1不但可以抵消內(nèi)皮細胞中的DLL4/Notch信號，還可以維持血管發(fā)育成熟等過程，使二者相互協(xié)調(diào)，相互平衡。

5.5 血管生成在皮膚科疾病中的作用 血管生成在多種皮膚病中都起著重要作用，在慢性炎癥性皮膚病，如銀屑病和特應(yīng)性皮炎中都存在血管生成改變。此外，像蕁麻疹、紫外線引起的損害和血管性水腫等急性炎癥性皮膚疾病也與血管生成因子的變化有關(guān)。在系統(tǒng)性硬化癥中，也存在促血管生成因子到抑制血管生成因子的轉(zhuǎn)換，這一轉(zhuǎn)換在該疾病的血管缺陷過程中發(fā)揮作用[30]。

其中一些皮膚科與血管生成相關(guān)的疾病也與HIF-VEGF-Notch信號相關(guān)。

血管瘤是嬰幼兒時期的一種良性血管腫瘤，血管生成被認為是其發(fā)病機制之一。通過血管瘤患者組織以及血管瘤干細胞(HemSCs)和血管瘤內(nèi)皮細胞(HemECs)的研究發(fā)現(xiàn)，人血管瘤內(nèi)皮細胞中VEGF-A和HIF-1α的表達顯著高于正常內(nèi)皮細胞，近年來發(fā)現(xiàn)普萘洛爾治療血管瘤的機制之一就是通過抑制HIF-1α、VEGF-A的表達發(fā)揮作用[31]。還證明Notch3信號的異常表達使得HemSCs衍生的壁細胞在血管瘤中異常分化并導(dǎo)致血管病變[32]。此外，與正常組織對比， Notch1、Notch4及Jagged1在血管瘤組織中表達增高[33]。

銀屑病的發(fā)生與慢性炎癥相關(guān)，而血管生成在銀屑病的發(fā)病機制中起著重要的作用，也是最早發(fā)現(xiàn)的炎癥組織學特征之一。通過對銀屑病患者皮損組織研究發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損區(qū)與非皮損區(qū)相比，Notch1、DLL4和Hrt1表達升高，以血管區(qū)表達最高。并且觀察到的Notch配體的差異可能與EC層、炎癥微環(huán)境、與VEGF的相互作用以及血管的成熟度有關(guān)。此外，Jagged1可介導(dǎo)免疫細胞的募集，使其浸潤到皮膚的表皮和真皮血管區(qū)域；Notch1已被證明在炎癥性關(guān)節(jié)炎中介導(dǎo)TNF-α誘導(dǎo)的滑膜細胞增殖。提示Notch在促進滑膜增殖和鄰近軟骨的侵襲中發(fā)揮作用[34，35]。這進一步支持Notch調(diào)節(jié)機制在銀屑病增生侵襲表皮層的作用，說明Notch配體-受體通路可能調(diào)控血管功能障礙和參與銀屑病發(fā)病機制的促炎機制，提示靶向阻斷該通路可能有重要的治療意義。

為了使癌細胞具有高增殖率，腫瘤需要迅速形成新的血管網(wǎng)。表明血管生成參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。Notch信號通路的異常表達，可能通過影響腫瘤中的血管生成，導(dǎo)致其過度形成功能不成熟的異常血管，增加腫瘤的轉(zhuǎn)移擴散。在皮膚腫瘤中，異常的Notch信號可導(dǎo)致皮膚癌的發(fā)展，如鱗狀細胞癌、基底細胞癌和惡性黑素瘤。人基底細胞癌中Notch1、Notch2、Jagged1表達降低，提示表皮中Notch信號的缺失可能導(dǎo)致基底細胞癌的發(fā)生。這表明Notch信號的靶向抑制劑可能可以通過抑制血管生成來抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[36]。

6 結(jié)論

血管生成在眾多疾病及生理過程中都扮演著重要的作用。HIF-VEGF-Notch信號通路在血管生成中的相互作用對血管生成過程有著重要的影響。明確它們之間的關(guān)系，可以通過調(diào)控其中的某個因子或通路而抑制或促進血管生成。而且這些信號因子及通路在抗腫瘤藥物研發(fā)、心腦血管疾病缺血后的血管再生、組織修復(fù)及免疫炎癥后導(dǎo)致的血管生成等諸多方面是一個熱點研究方向。如何將它們更加準確和更好的應(yīng)用，并發(fā)揮其在血管生成方面的優(yōu)勢也將是未來研究的方向。