吳飛躍 朱丹

生命體中，適量自由基與活性氧（ROS）、活性氮（RNS）物種在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中作為調(diào)節(jié)介質(zhì)發(fā)揮著重要作用[1]。當(dāng)產(chǎn)生和消除不平衡時可引起氧化應(yīng)激，通過炎癥、凋亡和細(xì)胞壞死、血腦屏障（BBB）破壞等機(jī)制導(dǎo)致重要生物分子和細(xì)胞損傷，參與腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病、癌癥及衰老等病理過程的發(fā)生。核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）是一種轉(zhuǎn)錄因子，通過結(jié)合并激活含有抗氧化反應(yīng)元件（ARE）啟動子的表達(dá)，參與機(jī)體的抗氧化過程，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。

腦卒中是60歲以上人群第二常見死亡原因，其中缺血性卒中的占比最高，是永久性殘疾的最常見原因[2]。急性卒中治療的主要目的是挽救缺血半暗帶。隨著靜脈溶栓治療以及血管內(nèi)血栓清除術(shù)的開展，急性缺血性卒中患者的治療獲得了顯著成效。但由于溶栓治療有限的治療時間窗和潛在的副作用，少數(shù)患者能從中受益，因此需要研究新的治療方法。缺血半暗帶細(xì)胞死亡的幾個關(guān)鍵因素已被確定，包括興奮毒性、氧化和亞硝化應(yīng)激以及炎癥。Nrf2的激活是通過轉(zhuǎn)錄上調(diào)Ⅱ期防御酶和抗氧化應(yīng)激蛋白，在細(xì)胞防御氧化應(yīng)激中起關(guān)鍵作用。大腦保護(hù)自己免受有害刺激并從缺血性損傷中恢復(fù)的內(nèi)源性防御機(jī)制是中風(fēng)研究的一個關(guān)鍵目標(biāo)[3]。本綜述將討論Nrf2-Keap1抗氧化反應(yīng)元件轉(zhuǎn)錄途徑在神經(jīng)保護(hù)中的可能作用以及探討這種途徑的激活是否能保護(hù)大腦免受BBB破壞。近年來，相關(guān)藥物的研究使Nrf2有望成為藥理學(xué)靶點，現(xiàn)回顧總結(jié)Nrf2在生理和病理條件下的作用及相關(guān)藥物的研究現(xiàn)狀，探討其與當(dāng)前潛在治療策略的相關(guān)性。

1 活性氧與氧化應(yīng)激

自由基和ROS、RNS物種起著雙重作用，在生物體內(nèi)以可控的方式產(chǎn)生。作為細(xì)胞信號傳導(dǎo)的重要組成部分，通過轉(zhuǎn)錄因子、代謝酶和膜通道等的激活或失活來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能[4]。當(dāng)產(chǎn)生和消除不能達(dá)到平衡時導(dǎo)致氧化損傷和組織功能障礙[5]。 RNS是一種能夠破壞生物分子的強(qiáng)氧化劑，與ROS一樣，RNS起著雙重作用，它們對生命系統(tǒng)既可能有害，也可能有益[6]。ROS和RNS被復(fù)雜的抗氧化系統(tǒng)平衡，以維持細(xì)胞中的氧化還原穩(wěn)態(tài)[5]。

2 Keap1-Nrf2-ARE通路的組成和作用

2.1 Nrf2Nrf2是細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子，具有高度保守的堿性區(qū)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，是結(jié)合轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的重要組成部分，控制一系列編碼解毒酶和抗氧化蛋白基因的表達(dá)[6]。Nrf2靶基因由抗氧化酶、參與異生素解毒的蛋白質(zhì)、參與修復(fù)及去除的蛋白質(zhì)、炎癥抑制因子以及其他轉(zhuǎn)錄因子的大網(wǎng)絡(luò)組成[7]。與谷胱甘肽（GSH）的合成、利用和再生，NADPH以及血紅素加氧酶-1（HO-1）的產(chǎn)生相關(guān)[5]，還介導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)酶及蛋白質(zhì)對親電和氧化攻擊的上調(diào)，成為細(xì)胞抗氧化的主要調(diào)節(jié)因子[4]。Nrf2蛋白包含605個氨基酸，形成6個功能域，命名為Neh1～6。Neh1為異二聚化結(jié)構(gòu)域，Nrf2通過該結(jié)構(gòu)域與其轉(zhuǎn)錄伴侶小Mafs相互作用，作為異二聚體結(jié)合到DNA上[8]。Neh2為Nrf2的負(fù)調(diào)控結(jié)構(gòu)域。Neh3與染色體ATPase解旋酶DNA結(jié)合蛋白CHD6結(jié)合，作為轉(zhuǎn)錄輔激活因子促進(jìn)抗氧化反應(yīng)元件（ARE）依賴基因的轉(zhuǎn)錄。Neh4和Neh5結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，結(jié)合另一個轉(zhuǎn)錄輔激活因子CBP。Neh6結(jié)構(gòu)域控制非Keap1依賴性負(fù)調(diào)節(jié)[9]。在正常條件下Nrf2定位在細(xì)胞質(zhì)中，與肌動蛋白結(jié)合蛋白Keap1相互作用，并被泛素-蛋白酶體途徑快速降解。來自活性氧或親電損傷的信號使Nrf2與Keap1解離，穩(wěn)定的Nrf2轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并反式激活其靶基因，進(jìn)一步參與機(jī)體的抗氧化過程[10]。

2.2 Keap1Keap1是Nrf2的負(fù)調(diào)節(jié)因子，廣泛表達(dá)并存在于細(xì)胞質(zhì)中，是感知內(nèi)源性氧化和親電應(yīng)激的中樞，在Nrf2的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[11]。Keap1由624個氨基酸的蛋白質(zhì)組成，包含3個主要結(jié)構(gòu)域:BTB二聚化結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸的IVR結(jié)構(gòu)域和C端Kech樣結(jié)構(gòu)域[9]。Keap1包含兩個已知的蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域:N末端區(qū)域的BTB結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)Keap1與Cullin3的結(jié)合，C末端區(qū)域的雙甘氨酸重復(fù)序列（DGR）結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)Keap1與Nrf2 Neh2的結(jié)合，共同參與催化Neh2結(jié)構(gòu)域賴氨酸殘基上Nrf2蛋白的多泛素化[5]。Keap1與Nrf2的關(guān)聯(lián)依賴于蛋白Keap1半胱氨酸殘基的活性巰基。興奮劑（如親電試劑和氧化劑）可以修飾這些半胱氨酸殘基，導(dǎo)致Nrf2從Keap1上解離。在基礎(chǔ)條件下，Nrf2被二聚體Keap1/Cullin3復(fù)合物錨定在胞質(zhì)溶膠中，Keap1通過直接結(jié)合到N端Neh2結(jié)構(gòu)域來抑制Nrf2活性。Keap1與Neh2的相互作用導(dǎo)致Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中隔離，并通過蛋白酶體增強(qiáng)Nrf2的降解，從而對反應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格調(diào)節(jié)[5]。親電物種水平的增加導(dǎo)致BTB和IVR結(jié)構(gòu)域中半胱氨酸殘基的共價修飾，并促使Cullin3解離和其他構(gòu)象變化，使Nrf2從Keap1上解離，從而增加了Nrf2的穩(wěn)定性，并進(jìn)一步促進(jìn)Nrf2轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。Nrf2與ARE序列在細(xì)胞核中結(jié)合，啟動細(xì)胞保護(hù)基因的轉(zhuǎn)錄[8]。這些共價修飾Keap1半胱氨酸殘基的幾個親電子小分子顯示出臨床前景[4]。

2.3 ARE保護(hù)基因的轉(zhuǎn)錄激活是由ARE的順式作用元件介導(dǎo)的。Nrf2與ARE結(jié)合，該通路控制基因表達(dá)，該基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物通過偶聯(lián)反應(yīng)和增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力參與解毒和消除反應(yīng)性氧化劑和親電試劑，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[12]。ROS和親電物質(zhì)水平升高和/或抗氧化能力降低而導(dǎo)致的細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的改變與ARE介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)有關(guān)。除了參與誘導(dǎo)型基因表達(dá)，ARE還參與控制組成型基因表達(dá)，意味著增強(qiáng)子在應(yīng)激和非應(yīng)激條件下起維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵作用[11]。

3 線粒體在氧化應(yīng)激中的作用

3.1 Nrf2與線粒體的直接作用線粒體在生物合成和凋亡中起重要作用，還與其他ROS細(xì)胞間存在相互作用。Nrf2通過提供還原型谷胱甘肽（GSH）參與維持線粒體氧化還原穩(wěn)態(tài)，此外還通過線粒體蛋白（如DJ-1、PGAM5和frataxin）對Nrf2活性進(jìn)行調(diào)節(jié)。在Nrf2和線粒體之間形成了一個相互調(diào)節(jié)的環(huán)[6]。在對Nrf2敲除小鼠分離的線粒體的實驗觀察表明，Nrf2在維持線粒體膜完整性方面的作用可能涉及線粒體膜通透性的轉(zhuǎn)變。Nrf2敲除細(xì)胞表現(xiàn)出自發(fā)凋亡增加，對化學(xué)誘導(dǎo)的線粒體損傷高度敏感，而化學(xué)保護(hù)劑激活Nrf2可防止線粒體損 傷[5]。Nrf2的過表達(dá)阻止H2O2誘導(dǎo)的線粒體網(wǎng)絡(luò)的破壞、線粒體膜電位的喪失。Nrf2定位于線粒體外膜表明Nrf2與線粒體組分直接相互作用以保持線粒體的完整性和功能。研究表明Nrf2與線粒體調(diào)節(jié)呈正相關(guān)，Nrf2線粒體保護(hù)激活劑的開發(fā)有望保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受氧化損傷和神經(jīng)變性[11]。

3.2 Nrf2影響干細(xì)胞的功能Nrf2也影響干細(xì)胞的線粒體功能，對干細(xì)胞自我更新、存活有影響。Nrf2活性狀態(tài)影響線粒體生理學(xué)包括生物發(fā)生、脂肪酸氧化、呼吸、ATP產(chǎn)生、氧化還原穩(wěn)態(tài)以及結(jié)構(gòu)完整性和動力學(xué)[13]。許多人類病理狀態(tài)和衰老與線粒體功能障礙有關(guān)的同時也被證實與抑制的Nrf2信號相關(guān)。干細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞氧化還原平衡可調(diào)節(jié)細(xì)胞再生的過程。當(dāng)暴露于氧化應(yīng)激時，Nrf2敲除干細(xì)胞的自發(fā)凋亡率增加，存活率降低。表明Nrf2在造血和干細(xì)胞存活中起關(guān)鍵作用[6]。

4 Nrf2與BBB的保護(hù)作用

BBB能選擇性限制血源性和外源性物質(zhì)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而保持大腦穩(wěn)態(tài)[14]。其完整性是由氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)的[15]。腦血管內(nèi)皮非常容易受到氧化應(yīng)激的影響。Nrf2能表達(dá)一種調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能的氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)緊密連接完整性和維持BBB功能中起著潛在作用。Nrf2缺失或下調(diào)導(dǎo)致應(yīng)激水平的增加將對緊密連接和粘附連接蛋白的表達(dá)產(chǎn)生負(fù)面影響，細(xì)胞間緊密連接復(fù)合物的組成改變是潛在的機(jī)制之一，這種機(jī)制可能損害BBB功能，并導(dǎo)致內(nèi)皮屏障阻力降低，進(jìn)而導(dǎo)致BBB功能障礙。Nrf2信號的持續(xù)激活可能有預(yù)防低血糖誘導(dǎo)的腦血管功能障礙的潛力，通過戊糖磷酸途徑重新引導(dǎo)代謝流量，從而對細(xì)胞生物能學(xué)和新陳代謝起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。BBB內(nèi)皮獨特的結(jié)構(gòu)和功能表型需要高能量，具有豐富的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白和線粒體，Nrf2介導(dǎo)的葡萄糖攝取調(diào)節(jié)可能對BBB的功能和完整性至關(guān)重要。BBB的完整性對確保最佳的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能至關(guān)重要，其在腦血管病理過程中的破壞可能是主要神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生和進(jìn)展的先兆[16]。

5 Nrf2相關(guān)藥物的治療進(jìn)展

5.1 Nrf2相關(guān)臨床前藥物的治療進(jìn)展近年來，多種植物提取物被證明與Nrf2防御途徑的激活相關(guān)：①獐牙菜苦苷（Swe）是從秦艽中分離得到的一種活性裂環(huán)烯醚萜苷類化合物。實驗研究證明Swe預(yù)處理促進(jìn)了Keap1-Nrf2復(fù)合物的Nrf2核易位，并增強(qiáng)了NAD（P）H:醌氧化還原酶-1（NQO1）和HO-1在體內(nèi)外的表達(dá)，被認(rèn)為是通過激活Nrf2途徑保護(hù)腦缺血再灌注損傷有前途的保護(hù)劑[17]。②根皮素屬于類黃酮家族，在蘋果和蘋果衍生產(chǎn)品中含量高。大量證據(jù)表明根皮素具有抗氧化特性，其機(jī)制與氧化應(yīng)激抑制和Nrf2防御途徑激活有關(guān)。根皮素預(yù)處理后Nrf2表達(dá)顯著增加，上調(diào)缺血/再灌注腦組織中Nrf2 mRNA和蛋白的表達(dá)，顯著抑制了氧化應(yīng)激過程[18]。這表明根皮素有利于治療與氧化應(yīng)激相關(guān)的缺血性卒中。③青藤堿作為一種從青藤莖和根中分離出來的生物堿，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)等廣泛作用。通過泛素化蛋白酶體介導(dǎo)的Keap1降解激活Nrf2信號通路[19]。青藤堿不僅被發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)離子通道對缺血性腦損傷發(fā)揮保護(hù)作用，還發(fā)現(xiàn)通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞對腦出血誘導(dǎo)的腦損傷起保護(hù)作用。實驗證明青藤堿可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中獲得，可通過BBB[17]。因此認(rèn)為青藤堿具有治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的巨大潛力。

5.2 Nrf2相關(guān)臨床藥物的治療進(jìn)展此外，許多臨床藥物也顯示出較好的治療前景。研究發(fā)現(xiàn)丹紅注射液可以提高抗氧化酶SOD 和GPX 的表達(dá)水平，可以通過調(diào)控Nrf2信號通路改善干細(xì)胞移植微環(huán)境，增加移植干細(xì)胞的存活率[20]。另外，也有研究證明在缺血紋狀體和皮質(zhì)中，人參或富馬酸二甲酯（DMF）預(yù)處理以Nrf2依賴的方式減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性膠質(zhì)增生，并通過Nrf2依賴機(jī)制對缺血性腦損傷產(chǎn)生持久的神經(jīng)保護(hù)作用[21]。 五味子提取物被證明可以顯著上調(diào)Nrf2，促進(jìn)Nrf2從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的移位，還可抑制Keap1的表達(dá)，并顯著增加Nrf2的穩(wěn)定性。敲除Nrf2可減弱五味子提取物對這些藥物代謝酶和藥物轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)節(jié)作用[22]。此外，李艷紅等[23]發(fā)現(xiàn)腺苷蛋氨酸聯(lián)合糖皮質(zhì)激素可通過激活Nrf2/Ho-1通路發(fā)揮抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等作用， 從而減輕細(xì)胞損傷。實驗數(shù)據(jù)顯示血栓通注射液可通過激活Nrf2-VEGF通路顯著增加了Nrf2、HO-1和NQO1的表達(dá)，促進(jìn)血管生成，可明顯改善神經(jīng)元功能缺損[24]。研究還發(fā)現(xiàn)三七總皂苷和人參皂甙Rb1通過激活Nrf2，抑制p38-VCAM-1信號通路可以促進(jìn)Nrf2蛋白的核易位，從而抑制血管粘附事件[25]。體外實驗數(shù)據(jù)證實，銀杏內(nèi)酯通過激活A(yù)kt/Nrf2通路可顯著降低ROS水平，提高SOD活性和HO-1和NQO1蛋白水平。在體內(nèi)可顯著降低大腦中動脈閉塞大鼠模型的梗死體積比，且呈劑量依賴性，還顯著上調(diào)HO-1、NQO1、SOD、p-Akt、p-Nrf2和Nrf2的蛋白水平，顯著抑制腦缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激損傷[26]。越來越多藥物不斷顯示出神經(jīng)保護(hù)作用，對該類藥物內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的不斷深入研究可為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新的途徑。

6 小結(jié)

Nrf2是抗氧化的主要調(diào)節(jié)劑，Nrf2抗氧化特性對多種疾病表現(xiàn)出多重保護(hù)作用，為藥物的開發(fā)開辟了新途徑。然而，基于目前對急性腦梗死損傷和修復(fù)過程的認(rèn)識不完善，需要進(jìn)一步的研究來建立“治療窗”，以明確Nrf2的激活在腦卒中發(fā)作前后如何提供腦保護(hù)。了解Nrf2介導(dǎo)的氧化還原信號的分子機(jī)制，可以為神經(jīng)保護(hù)的潛在治療提供依據(jù)。BBB損傷是缺血性腦損傷的一個關(guān)鍵病理過程，也是重癥腦卒中和溶栓治療誘發(fā)出血的潛在因素。因此，保護(hù)BBB是一個重要的治療靶點，它不僅可以降低溶栓過程中的出血風(fēng)險，還可以改善重癥腦卒中的預(yù)后。進(jìn)一步了解Nrf2在卒中發(fā)生后BBB保護(hù)中的具體作用及相關(guān)機(jī)制將為探索缺血性卒中的有效和安全的治療方法提供思路。