王雪青，左進華，閆志成，史君彥，王 清,*，關(guān)文強

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蔬菜產(chǎn)后處理重點實驗室，果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工北京市重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點實驗室，北京 100097；2.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

微納米氣泡是當(dāng)下研究的熱點，其由微米氣泡和納米氣泡組成，其中微米氣泡直徑小于50 μm，納米氣泡直徑小于1 μm，因氣泡體積極其細微，所以在水中受到的浮力小，上升速率緩慢[1]。微納米氣泡比表面積大，氣體溶解能力強[2]，寬pH值范圍內(nèi)表面攜帶負電荷，強酸性條件帶正電荷[3]，電荷與周圍離子形成雙電層，所以氣泡表面存在電勢差即ζ電位[4]，這種高電位在氣泡破裂時產(chǎn)生沖擊波促進水分解產(chǎn)生羥自由基[5]。羥自由基是由微納米氣泡產(chǎn)生的外源活性氧（reactive oxygen species，ROS），中等水平的ROS具有生理促進和氧化作用[6]。微納米氣泡在水中的穩(wěn)定性與ζ電位有關(guān)，它可阻礙氣泡間的聚集[7]，也與氣泡所受浮力有關(guān)[5]。因此微納米氣泡可懸浮數(shù)月，延長了氣體在水中停留的時間。

臭氧作為一種強氧化劑，可以氧化呼吸代謝釋放的乙烯、乙醇等氣體，并具有殺菌特性，在果蔬采后保鮮方面得到廣泛應(yīng)用[8-9]。臭氧在水中不穩(wěn)定、易分解[10]，與微納米氣泡結(jié)合可增加水中溶解量，通過連續(xù)鼓泡供應(yīng)維持其濃度恒定[11-12]。目前臭氧微納米氣泡（ozone micro-nano-bubbles，Ozone MNBs）在果蔬應(yīng)用方面有一定的研究進展，He Huaming等[11]以蒸餾水為對照，采用2.3 mg/L Ozone MNBs處理番茄赤星病菌分生孢子懸浮液5 min，孢子數(shù)量減少3.5 個數(shù)量級，并且該質(zhì)量濃度噴灑番茄植株未對其生長造成不利影響，可用于生長過程中的病菌防治。張慧娟等[13]指出與傳統(tǒng)機械振動清洗相比，Ozone MNBs洗滌降低了對葉類蔬菜的損傷。這些已有研究主要針對Ozone MNBs的微生物殺菌和清洗作用開展，缺乏對果蔬生理指標(biāo)的探究。在Lee等[14]臭氧微米氣泡對栗子具有保鮮效果啟發(fā)下，以He Huaming[11]和張慧娟[13]等的研究為基礎(chǔ)，通過生理指標(biāo)探究Ozone MNBs是否具有低機械傷蔬菜保鮮作用。

菠菜（Spinacia oleraceaL.）水分含量高，富含維生素、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)素[15]。新鮮的菠菜葉面面積大、氣孔多[16]，呼吸作用和酶活性均處于較高水平[17]，并且葉片和葉莖部位十分脆弱，處理過程中易受傷。所以本實驗以菠菜為材料，以1～10 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)Ozone MNBs對其進行預(yù)實驗，多次重復(fù)實驗證實質(zhì)量濃度為4 mg/L時處理的菠菜感官評分最高。因此，本實驗研究（20±1）℃貯藏條件下，4 mg/L Ozone MNBs處理對菠菜采后保鮮的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠菜采購于北京超市發(fā)連鎖有限公司，選擇新鮮、無機械傷、無病蟲害的菠菜進行實驗。

三氯乙酸 天津百奧泰科技發(fā)展有限公司；2-硫代巴比妥酸 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；丙酮、乙醇、硫酸 北京科創(chuàng)順達科技有限公司；四水合鉬酸銨、磷酸氫二鈉 西隴化工股份有限公司；草酸、乙二胺四乙酸、偏磷酸、乙酸 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；愈創(chuàng)木酚、體積分?jǐn)?shù)30%過氧化氫 南開大學(xué)精細化學(xué)實驗廠。

1.2 儀器與設(shè)備

3S-T臭氧發(fā)生器 北京同林科技有限公司；MF-5000微納米氣泡發(fā)生裝置 上海行恒科技有限公司；CR-300色差計 日本柯尼卡美能達公司；GXH-3051呼吸機 北京均方理化科技研究所；7820A乙烯機美國安捷倫科技有限公司；D-37520離心機 北京誠茂興業(yè)科技發(fā)展有限公司；DDS-307A電導(dǎo)率儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV-1800紫外分光光度計日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

兩種處理：一組為Ozone MNBs組，將臭氧發(fā)生器接通在微納米氣泡發(fā)生裝置上對其連續(xù)供應(yīng)臭氧，對300 L蒸餾水充氣，控制臭氧質(zhì)量濃度為4 mg/L，將菠菜浸泡在Ozone MNBs中處理5 min；一組為CK組，未通入Ozone MNBs，其他條件相同。處理后的菠菜表面晾干后裝入0.03 mm厚聚乙烯袋折口存放，每袋10 棵，3 次重復(fù)共48 袋。置于（20±1）℃庫貯藏，從0 d開始每隔2 d進行感官評價和取樣測定。取樣時，將整棵菠菜切碎，放入液氮冷凍，再將樣品存放于-80 ℃冰箱中，用于后期生理指標(biāo)的測定。

1.3.2 感官評價

感官評分采用徐冬穎等[17]的方法，經(jīng)過培訓(xùn)的6 人依據(jù)對菠菜的色澤、腐爛程度等特征進行評價，采用9 分制。評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示，結(jié)果取平均值。

表1 菠菜感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of spinach

1.3.3 黃化指數(shù)和色差的測定

黃化指數(shù)測定采用徐靜等[18]的方法并稍作修改，依據(jù)菠菜葉片的黃化面積對其分級，0級，黃化面積率為0；1級，黃化面積率≤25%；2級，25%＜黃化面積率≤50%；3級，50%＜黃化面積率≤75%；4級，黃化面積率＞75%。黃化指數(shù)按式（1）計算，結(jié)果取平均值。

色差采用色差計測量，每組隨機選取3 個葉片，葉片正反面各取3 個點，測定其L*、a*、b*值，結(jié)果取平均值。

1.3.4 細胞膜滲透率和丙二醛含量的測定

細胞膜滲透率采用張乙博等[19]的方法測定，稱取2.0 g葉肉圓片，加入20 mL去離子水浸泡，采用電導(dǎo)率儀測定初始去離子水電導(dǎo)率（P0/（μS/cm））。輕輕振蕩10 min，記錄此時電導(dǎo)率（P1/（μS/cm））。放入沸水浴煮沸10 min，冷卻后加水至原刻度，記錄最大電導(dǎo)率（P2/（μS/cm））。細胞膜滲透率按式（2）計算。

丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法[20]測定，稱取1.0 g樣品，加入5.0 mL 100 g/L三氯乙酸溶液，于4 ℃、13 000×g離心20 min，收集2.0 mL上清液于試管中。向試管加入2.0 mL 6.7 g/L硫代巴比妥酸溶液，沸水浴煮沸20 min，冷卻后再次離心，測定其在波長450、532 nm和600 nm處吸光度。

1.3.5 呼吸強度和乙烯釋放量的測定

呼吸強度采用張引引等[21]的方法測定，呼吸機預(yù)熱30 min，將菠菜放入封密性良好的呼吸室，置于（20±1）℃貯藏庫。30 min后記錄CO2釋放量，之后每隔10 min記錄一次，共記錄3 次。呼吸強度以單位時間內(nèi)每千克果蔬在呼吸過程中釋放的CO2的質(zhì)量表示，單位為mg/（kg·h）。

乙烯釋放量采用曹建康等[22]的方法測定，菠菜放入密封盒中，置于（20±1）℃貯藏庫。1 h后抽取三針氣體，利用氣相色譜儀測定乙烯釋放量。

1.3.6 葉綠素含量和VC含量的測定

葉綠素含量采用Shi Junyan等[23]的方法并稍作修改。該實驗在避光條件下進行，稱取0.5 g樣品，加入6.0 mL丙酮和乙醇混合液（2∶1，V/V）提取，于4 ℃、13 000×g離心10 min，取上清液測定其在663 nm和645 nm波長處的吸光度。

VC含量采用鉬酸銨比色法[24]測定，稱取1.0 g樣品，加入5.0 mL 0.05 mol/L 草酸-0.2 mmol/L 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液，于4 ℃、13 000×g離心10 min，收集2.0 mL上清液于試管中，向試管加入3.0 mL草酸-EDTA、0.5 mL體積分?jǐn)?shù)30%偏磷酸-乙酸、1.0 mL體積分?jǐn)?shù)5%硫酸和2.0 mL 5 g/100 mL鉬酸銨溶液，搖勻放于80 ℃恒溫水浴鍋保持10 min，冷卻后加蒸餾水定容至10 mL，測定在760 nm波長處吸光度。

1.3.7 過氧化氫含量的測定

過氧化氫含量采用陳拓等[25]的方法測定，稱取2.0 g樣品，加入2.0 mL預(yù)冷的丙酮，于4 ℃、13 000×g離心20 min，取1.0 mL上清液于試管中。向試管加入0.2 mL濃氨水和0.1 mL體積分?jǐn)?shù)20%四氯化鈦，再次離心，棄去上清液，用冷丙酮洗滌沉淀至除去色素，向沉淀中加入3.0 mL 2 mol/L硫酸溶解，于508 nm波長處測定吸光度。

1.3.8 過氧化物酶、過氧化氫酶和抗壞血酸過氧化物酶活力的測定

稱取1.0 g樣品，加入5.0 mL 0.1 mol/L pH 7.8磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%聚乙烯吡咯烷酮），于4 ℃、13 000×g離心30 min，得到上清液，即酶提取液。

過氧化物酶（peroxidase，POD）活力采用愈創(chuàng)木酚法[26]測定。取0.1 mL酶提取液于試管中，向試管加入1.0 mL PBS、0.9 mL 0.2%（體積分?jǐn)?shù)，后同）愈創(chuàng)木酚和1.0 mL 0.3% H2O2溶液，迅速混勻倒入比色皿，置于分光光度計樣品室，測定反應(yīng)體系在470 nm波長處的吸光度。

過氧化氫酶（catalase，CAT）活力采用Platt-Aloia等[27]的方法測定。取0.1 mL酶提取液于試管，再向試管中加入1.9 mL PBS和1.0 mL 0.3% H2O2溶液，迅速混勻倒入比色皿中，置于分光光度計樣品室，測定體系在240 nm波長處的吸光度。

抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力采用Wang Qing等[28]方法測定。稱取1.0 g樣品，加入5.0 mL 0.1 mol/L pH 7.5 PBS（含0.1 mmol/L EDTA、1 mmol/L 抗壞血酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%聚乙烯吡咯烷酮），于4 ℃、13 000×g離心20 min，收集0.1 mL酶提取液于試管中。向試管加入2.6 mL PBS（含0.1 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L抗壞血酸）和0.3 mL 2 mmol/L H2O2溶液，迅速混勻倒入比色皿，利用分光光度計測定反應(yīng)體系在290 nm波長處的吸光度。

以每克鮮質(zhì)量樣品每分鐘吸光度增加1為1 個POD活力單位；以每克鮮質(zhì)量樣品每分鐘吸光度減少0.01為1 個CAT、APX活力單位。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用EXCEL 2016軟件進行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行Duncan’s差異顯著性分析（P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著）。運用Origin 2017軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ozone MNBs處理對菠菜感官品質(zhì)的影響

圖1 Ozone MNBs處理對菠菜感官品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of ozone MNB treatment on sensory quality of spinach

感官評分是對菠菜色澤、新鮮度和腐敗程度等外觀品質(zhì)最直接的評價。由圖1可知，隨著貯藏時間的延長，菠菜感官品質(zhì)呈下降趨勢，且4～8 d時Ozone MNBs組菠菜的品質(zhì)顯著高于CK組（P＜0.05）。這是因為微納米氣泡粒徑極小，能深入清洗果蔬縫隙等狹小空間[29]，并且氣泡在破裂瞬間激發(fā)產(chǎn)生大量ROS，臭氧在ROS輔助下增強了對表面附著污染物的氧化分解效果[30]，所以經(jīng)Ozone MNBs處理的菠菜色澤鮮亮、腐敗程度低。表明Ozone MNBs處理可有效維持菠菜的感官品質(zhì)。

2.2 Ozone MNBs處理對菠菜黃化指數(shù)和色差的影響

圖2 Ozone MNBs處理對菠菜黃化指數(shù)的影響Fig.2 Effect of ozone MNB treatment on yellowing index of spinach

果蔬在采后貯藏期間易發(fā)生黃化現(xiàn)象，這與果蔬的衰老、葉綠素降解和乙烯對色素代謝調(diào)控等多種因素有關(guān)[31]。圖2顯示，兩種處理的菠菜葉片黃化程度隨貯藏時間的延長呈上升趨勢。貯藏4 d后，葉片黃化速率加快，Ozone MNBs組菠菜黃化指數(shù)雖低于CK組，但兩組的差異并不顯著（P＞0.05）。

表2 Ozone MNBs處理對菠菜色差的影響Table 2 Effect of ozone MNB treatment on color difference of spinach

可通過亮度L*值和色度a*值（正負表示偏紅綠）、b*值（正負表示偏黃藍）來表示樣品的色澤[32]。由表2可知，貯藏過程中Ozone MNBs組L*、a*值顯著低于CK組（P＜0.05），表明經(jīng)Ozone MNBs處理的菠菜色澤明亮且偏綠，這是因為氣泡對菠菜表面進行了深度清洗，與感官評價結(jié)果一致。兩個組b*值隨貯藏時間延長呈先降低后升高趨勢，且Ozone MNBs組菠菜的b*值始終低于CK組，且6～8 d時差異顯著（P＜0.05），說明臭氧微納米處理后的菠菜葉片黃化程度低，與黃化指數(shù)結(jié)果相符合。

2.3 Ozone MNBs處理對菠菜細胞膜滲透率和丙二醛含量的影響

圖3 Ozone MNBs處理對菠菜細胞膜滲透率（A）和丙二醛含量（B）的影響Fig.3 Effect of ozone MNB treatment on cell membrane permeability (A)and MDA content (B) of spinach

果蔬采后伴隨著后熟衰老過程，細胞膜降解是細胞組織衰老的信號，降解引發(fā)膜通透性增加，胞內(nèi)離子外泄，所以常用細胞膜滲透率表示細胞在貯藏過程中完整性的變化[33]。圖3A顯示，貯藏2 d后，CK組細胞膜滲透率幾乎呈線性增加，Ozone MNBs組細胞膜滲透率低于CK組，且6 d時兩組差異顯著（P＜0.05）。貯藏8 d時Ozone MNBs組滲透率僅為15.54%，表明此時細胞完整性較好。這是因為Ozone MNBs清洗果蔬時利用氣泡破裂產(chǎn)生的沖擊波對菠菜表面的雜質(zhì)吸附洗滌，對葉菜造成的損傷較小[13]。果蔬受到損傷時誘導(dǎo)細胞膜中不飽和脂肪酸發(fā)生膜質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基促進細胞膜透性增加，丙二醛作為膜質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，其含量可用來反映過氧化作用的程度[34]。由圖3B可知，丙二醛含量隨貯藏時間的延長呈上升趨勢，貯藏4～8 d時CK組丙二醛含量極顯著高于Ozone MNBs組（P＜0.01），說明Ozone MNBs組菠菜細胞膜脂質(zhì)過氧化程度低，細胞膜損傷程度小，這與細胞膜滲透率結(jié)果一致。表明Ozone MNBs是一種低機械傷處理方式。

2.4 Ozone MNBs處理對菠菜呼吸強度和乙烯釋放量的影響

圖4 Ozone MNBs處理對菠菜呼吸強度（A）和乙烯釋放量（B）的影響Fig.4 Effect of ozone MNB treatment on respiratory intensity (A) and ethylene release (B) from spinach

采后果蔬在呼吸和乙烯的刺激下，自身逐漸走向衰老、死亡[35]。呼吸作用的強弱反映了物質(zhì)消耗的快慢，這是因為果蔬采后失去了養(yǎng)分供應(yīng)，生命活動主要以物質(zhì)分解代謝為主，所以呼吸強度是影響果蔬耐貯性的重要因素[36]。圖4A顯示，貯藏過程中，兩個處理組菠菜呼吸強度均呈上升趨勢，CK組菠菜呼吸強度極顯著高于Ozone MNBs組（P＜0.01），8 d時CK組呼吸強度達到643.34 mg/（kg·h），不利于菠菜的保鮮。乙烯是一種植物內(nèi)源激素，Aked[35]認為它能夠刺激和協(xié)調(diào)果蔬成熟過程中發(fā)生的生理變化，加速成熟衰老進程，所以在采后貯藏中常檢測內(nèi)源乙烯的釋放量。由圖4B可知，菠菜在貯藏4 d時達到最大乙烯釋放量，CK組最大乙烯釋放量為0.395 5 μL/（kg·h）。并且CK組菠菜乙烯釋放量始終高于Ozone MNBs組，4～6 d時兩組差異極顯著（P＜0.01）。已有研究表明臭氧處理對甜瓜、柿子和梨等具有降低呼吸強度、抑制乙烯釋放的作用[37-38]。說明Ozone MNBs處理可以有效抑制菠菜的呼吸作用和乙烯的釋放，減緩自身消耗和衰老進程，延長菠菜的貯藏期。

2.5 Ozone MNBs處理對菠菜葉綠素含量和VC含量的影響

圖5 Ozone MNBs處理對菠菜葉綠素（A）和VC（B）含量的影響Fig.5 Effect of ozone MNB treatment on chlorophyll (A) and vitamin C (B)contents of spinach

葉綠素是植物體內(nèi)含量最高并且能參與光合作用的色素[39]，其降解引起的黃化現(xiàn)象使葉片新鮮度下降，其含量下降是植物衰老的外在標(biāo)志[40]。圖5A顯示，貯藏過程中兩個處理組的菠菜葉綠素含量均呈下降趨勢。貯藏2～6 d時葉綠素含量保持平穩(wěn)，Ozone MNBs組葉綠素含量極顯著高于CK組（P＜0.01）。說明貯藏期間CK組菠菜在顏色和新鮮度方面不如Ozone MNBs組，這與感官評價結(jié)果一致。

新鮮的菠菜中含有豐富的VC，但它極不穩(wěn)定，貯藏期間含量會迅速下降，這與菠菜的衰老和采后品質(zhì)有關(guān)[41]，所以常用VC含量評價果蔬的營養(yǎng)品質(zhì)和貯藏效果[22]。由圖5B可看出，貯藏過程中菠菜VC含量處于快速損失的狀態(tài)，貯藏4 d后，Ozone MNBs組VC含量極顯著高于CK組（P＜0.01），8 d時CK組VC含量減少至0.011 0 mg/g。表明Ozone MNBs處理可有效緩解葉綠素和VC的損失，維持菠菜的外觀品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)。

2.6 Ozone MNBs處理對菠菜過氧化氫含量的影響

植物在正常條件和遭受不良環(huán)境脅迫時會產(chǎn)生ROS，過量的ROS會導(dǎo)致植物品質(zhì)劣變[42]。過氧化氫是ROS中活性最為穩(wěn)定的一種[42]，它對植物的作用存在毒性閾值，低濃度時作為信號分子調(diào)節(jié)細胞對環(huán)境的適應(yīng)性，高濃度時導(dǎo)致細胞氧化損傷甚至死亡[43]，而植物體內(nèi)存在的抗氧化防御系統(tǒng)可以保護其免受傷害。圖6顯示，Ozone MNBs組和CK組過氧化氫含量分別在貯藏2 d和4 d時達到峰值，之后呈下降趨勢，貯藏4 d后，CK組過氧化氫含量極顯著高于Ozone MNBs組（P＜0.01）。表明Ozone MNBs處理可以減少過氧化氫的積累，減輕菠菜的氧化損傷。

圖6 Ozone MNBs處理對菠菜過氧化氫含量的影響Fig.6 Effect of ozone MNB treatment on hydrogen peroxide content of spinach

2.7 Ozone MNBs處理對菠菜POD、CAT和APX活力的影響

圖7 Ozone MNBs處理對菠菜POD（A）、CAT（B）、APX（C）活力的影響Fig.7 Effect of ozone MNB treatment on peroxidase (A), catalase (B)and ascorbate peroxidase (C) activity of spinach

POD、CAT和APX是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，三者以不同的作用方式協(xié)同清除體內(nèi)過氧化氫，降低對細胞組織造成的氧化傷害，提高植物的抗逆境脅迫能力[44]。由圖7A～C可以看出，Ozone MNBs組菠菜POD、CAT和APX活力均高于CK組，并且POD活力最高。貯藏過程中，菠菜POD活力呈先降低后升高的趨勢，6 d時兩個處理組存在極顯著差異（P＜0.01）；CAT活力整體呈下降趨勢，2～4 d時CK組存在上升趨勢；APX活力呈下降趨勢，并且兩組變化趨勢相似，貯藏4 d后，Ozone MNBs組APX活力顯著高于CK組（P＜0.05）。章寧瑛等[45]研究證實，4.28 mg/m3臭氧處理組藍莓與對照組（未處理）相比能較好地保持POD、CAT和APX活力，使藍莓果實呈現(xiàn)良好的抗逆性。表明Ozone MNBs處理可保持抗氧化酶的活力，降低過氧化氫積累對菠菜機體造成的氧化損害，減緩品質(zhì)的劣變。

3 結(jié) 論

本實驗探究了Ozone MNBs的低機械傷保鮮作用，以易受損傷的菠菜為實驗材料，測定其在貯藏期間的生理指標(biāo)。由細胞膜滲透率和丙二醛含量指標(biāo)可知，Ozone MNBs處理可以有效降低細胞膜的損傷和丙二醛的積累，保持細胞的完整性，表明其具有低機械傷清洗作用。從其他指標(biāo)可以看出，Ozone MNBs處理能延緩葉綠素和VC含量的下降，維持其感官品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)，通過抑制呼吸作用和乙烯的釋放，減少養(yǎng)分的消耗，提高菠菜的耐貯性，并提高抗氧化酶的活性延緩過氧化氫積累對品質(zhì)的劣變影響，從而具有保鮮作用。但從目前研究來看，缺乏微納米氣泡對葉綠素、酶等生理指標(biāo)作用機理的研究。此外，微納米氣泡破裂會帶來外源ROS，而過高的ROS積累對細胞產(chǎn)生病理效應(yīng)，并且Ahmed等[5]發(fā)現(xiàn)氧氣納米氣泡產(chǎn)生的ROS對作物的生長存在植物特異性，Ozone MNBs處理對果蔬保鮮是否也存在這種特異性，還需進一步的研究探索。