馬 超，孫 璐，趙 瑜，薄 劍

非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤中最為普遍的一類，臨床上具有高度的異質(zhì)性[1]。這種異質(zhì)性不僅體現(xiàn)在患者不同的癥狀表現(xiàn)，更體現(xiàn)在對治療反應(yīng)的差異。腫瘤臨床異質(zhì)性本質(zhì)上是由其生物學(xué)異質(zhì)性決定的，涉及腫瘤細(xì)胞之間復(fù)雜的克隆進(jìn)化關(guān)系[2]。理解腫瘤異質(zhì)性是理解腫瘤發(fā)生與進(jìn)展機(jī)制的關(guān)鍵，對腫瘤的診斷、預(yù)后、監(jiān)測及治療也有非常重要的價值[2]。在惡性B淋巴瘤的B淋巴細(xì)胞中存在天然的克隆標(biāo)志物，在抗原刺激下，每個B細(xì)胞可以通過連接免疫球蛋白重鏈基因的一個V(variable)、一個D(diversity)和一個J(joining)片段形成一個獨(dú)特的VDJ序列，特定的VDJ重排序列可以用來追蹤單個B細(xì)胞的克隆進(jìn)化[3]。這些VDJ重排形成了多樣性的B細(xì)胞受體(B-cell Receptor，BCR)區(qū)域，用來識別不同的抗原，其中互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)的序列對BCR的抗原識別貢獻(xiàn)最多[4]。

針對B細(xì)胞表面受體的V基因和J基因及其保守區(qū)域設(shè)計多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物，通過多重PCR技術(shù)擴(kuò)增B細(xì)胞的CDR3區(qū)域，再結(jié)合新一代高通量測序技術(shù)(NGS)，開展CDR3區(qū)域的高深度測序和識別，以此獲得免疫細(xì)胞多樣性信息，這一技術(shù)被稱為針對B細(xì)胞的免疫組庫測序技術(shù)[5]。對IgH重排的深度測序，可獲得數(shù)百萬條具體量化的VDJ序列信息，全面評估免疫細(xì)胞的克隆多樣性，可用于淋巴瘤的診斷與預(yù)后[6]；同時，測序可以得到樣本中的特異性寡克隆序列，可將其作為特異性標(biāo)志物，用于后續(xù)微小病灶殘留(minimal residual disease，MRD)的檢測與復(fù)發(fā)監(jiān)測[7-9]。2015年，Oki等[10]利用該技術(shù)檢測了17例經(jīng)典霍奇金淋巴瘤組織，并在12例患者組織中找到了淋巴腫瘤特異性寡克隆序列，證實(shí)了免疫組庫技術(shù)對淋巴瘤細(xì)胞組織中IgH重排檢測的可行性。

此外，Kwok等[11]進(jìn)行了基于血漿游離DNA(cfDNA)的免疫組庫測序，對非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤治療前、治療中和治療后的特異性寡克隆細(xì)胞進(jìn)行定量檢測。Roschewski等利用免疫組庫測序技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對臨床非霍奇金淋巴瘤患者的循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)的動態(tài)監(jiān)測，證實(shí)淋巴瘤的多個腫瘤克隆和亞克隆組成在治療的選擇性壓力下，會隨著時間的推移不斷進(jìn)化。在基于ctDNA的無創(chuàng)監(jiān)測中，免疫組庫測序技術(shù)克服了淋巴瘤組織活檢中成像掃描的技術(shù)局限性，可在分子水平上實(shí)時分析耐藥疾病的分子特征。尤其是在針對體細(xì)胞突變復(fù)發(fā)性疾病時，可解決臨床遇到的腫瘤時間異質(zhì)性及克隆進(jìn)化的問題，還能輔助臨床治療耐藥性的機(jī)制研究，從而指導(dǎo)精準(zhǔn)治療[12]。因此，本研究嘗試在非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤中，利用NGS檢測患者初診時的組織與血漿樣本中具體量化的CDR3序列信息，評估IgH重排與B細(xì)胞克隆的多樣性，并分析其與臨床病例特征之間的相關(guān)性。另外，測序得到的樣本中特異性寡克隆序列，有望作為特異性的生物標(biāo)志物用于后續(xù)MRD的檢測及復(fù)發(fā)監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 病例與樣本 收集2019年3月至2020年5月解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心血液科治療的非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤患者15例，包括11例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)，1例濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，F(xiàn)L)，2例邊緣區(qū)淋巴瘤(marginal zone B-cell lymphoma，MZBL)，1例邊緣區(qū)淋巴瘤伴局部彌漫大B轉(zhuǎn)化。病理診斷根據(jù)2016年WHO關(guān)于淋巴瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。采集所有患者初診時石蠟切片組織樣本和治療前的外周血樣本。石蠟組織切片厚度為4 μm，至少10張切片。外周血樣本要求10 mL，EDTA管采集，4 h之內(nèi)離心分離血漿，保存于-20 ℃冰箱。

1.2 成熟B細(xì)胞淋巴瘤患者的臨床特征 15例非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤患者一般臨床特征如表1所示，包含9例女性，6例男性，平均年齡為51歲。本研究組把組織以及血漿中的克隆指數(shù)、組織中特異性寡克隆數(shù)與Ann Arbor分期、IPI得分、血清LDH水平等各項臨床病理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，由于樣本數(shù)限制，尚未發(fā)現(xiàn)這些指標(biāo)與各項臨床病理指標(biāo)存在顯著相關(guān)性。

表1 患者臨床病理特征

1.3 儀器與試劑 本研究中切片樣本所用的DNA提取試劑盒為DNeasy Blood &Tissue kit(Qiagen公司,美國)，血漿樣本所用的cfDNA提取試劑盒為QIAamp Circulating Nucleic Acid kit(Qiagen公司,美國)基因擴(kuò)增儀為(ABI公司，美國)，VDJ區(qū)域擴(kuò)增使用VDJ擴(kuò)增試劑盒(北京MyGenostics公司)，高通量測序儀為Hiseq Novaseq(Illumina，美國)。

1.4 DNA提取 分別根據(jù)試劑盒的說明書提取石蠟切片組織樣本與血漿樣本的cfDNA，-20 ℃冰箱保存。

1.5 VDJ擴(kuò)增子建庫與測序 根據(jù)VDJ擴(kuò)增試劑盒(MyGenostics公司，北京)說明書進(jìn)行擴(kuò)增。組織樣本初始DNA起始量為1μg，血漿樣本初始cfDNA起始量為10 ng以上。通過多重PCR技術(shù)擴(kuò)增VDJ區(qū)域，獲得抗原受體基因區(qū)域；然后將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物純化后建庫，通過MyGenostics公司的二代測序平臺Illumina Novaseq測序儀進(jìn)行測序，讀長為兩端各150個堿基。每個樣本的測序數(shù)據(jù)量不少于3G，Q30>90%，獲得的序列(reads)數(shù)>300萬。對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，去除低質(zhì)量帶接頭序列，就得干凈序列(clean reads)進(jìn)行后續(xù)比對分析，參考序列來自于國際免疫遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(IMGT,http://www.imgt.org/)。根據(jù)比對結(jié)果，統(tǒng)計V/D/J基因的頻率信息，提取CDR區(qū)域序列，評估免疫組庫的多樣性，進(jìn)行樣本間及樣本內(nèi)對比分析和聚類分析，鑒定淋巴瘤特異性寡克隆序列[13]。通過克隆指數(shù)(Clonality)分析來評估B細(xì)胞克隆的多樣性[14]。

1.6 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，利用Spearman相關(guān)系數(shù)評估相關(guān)性，兩組間比較采用雙尾兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫球蛋白重鏈基因的VDJ重排 經(jīng)過質(zhì)控過濾，一共得到4.9865億條干凈序列，其中3.6492億條序列可比對到參考基因組上，平均每個組織樣本中可比對到參考基因組上的序列為1 068萬條序列，每個血漿樣本中可比對到參考基因組上的序列為1 364萬條序列。因此，可以全面量化檢測互補(bǔ)決定區(qū)(CDR3)序列。在組織樣本中，平均檢出11 212條唯一的CDR3序列，范圍從515到41 476條；在血漿樣本中，平均檢出1 689條唯一的CDR3序列，范圍從238到6 499條，表2?？寺≈笖?shù)分析結(jié)果顯示，血漿與組織中的克隆指數(shù)沒有顯著相關(guān)性，圖1。

表2 測序結(jié)果摘要

本研究組在73.3%(11/15)的患者組織中檢出特異性寡克隆序列，在其對應(yīng)的血漿樣本中，72.7%(8/11)存在組織中特異性寡克隆序列。比較了存在特異性寡克隆的樣本與沒有特異性寡克隆的樣本的克隆指數(shù)，發(fā)現(xiàn)存在特異性寡克隆的樣本中，克隆指數(shù)顯著高于沒有特異性寡克隆的樣本(圖1)，表明存在特異性寡克隆的樣本的IgH重排多樣性較低。

圖1 2組克隆能力比較(*P<0.05)

測序結(jié)果同時可以得到完整的CDR3序列與比例，以及各個V、D、J基因片段的使用情況，患者中代表性的特異性寡克隆組成如圖2所示，每個樣本中最主要的特異性寡克隆序列信息如表3所示。比較IgHV基因片段組成，發(fā)現(xiàn)V3家族參與IgH重排最多，為7例(63.6%)。另外，比較組織與血漿中的特異性寡克隆檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)二者的比例具有顯著相關(guān)性(Spearman rho=0.803,P=0.003)。

表3 確證的患者最特異性基因重排序列

3 討論

IgH重排是B淋巴細(xì)胞分化成熟過程中非常重要的特征性事件,存在于絕大多數(shù)B細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤中。NGS檢測IgH的VDJ片段重排，可以全面量化評估IgH重排與B細(xì)胞克隆的多樣性，用于B細(xì)胞性淋巴瘤的診斷、預(yù)后評估及復(fù)發(fā)監(jiān)測[6,15]。本研究之前初步探討了通過NGS檢測IgH重排作為非霍奇金淋巴瘤診斷與監(jiān)測生物標(biāo)志物的可行性[16]。在本研究中，收集了15例成熟B細(xì)胞淋巴瘤初診時的組織與血漿樣本，通過高通量測序檢測其IgH重排，結(jié)合臨床病理治療探索其臨床價值。

這15例患者的組織與血漿樣本全部成功測序，每個樣本的CDR3區(qū)都獲得了至少幾百萬條的測序序列支撐，保證了數(shù)據(jù)的可靠性。73.3%(11/15)的患者組織中可以檢出特異性寡克隆擴(kuò)增，這與先前的報道一致，其發(fā)現(xiàn)在82例非霍奇金淋巴瘤中，64.6%的組織樣本存在淋巴瘤特異性IgH重排[17]。在其對應(yīng)的血漿樣本中，72.7%(8/11)存在組織中的特異性寡克隆，并且二者的比例具有顯著相關(guān)性。這表明淋巴瘤中血漿樣本的IgH重排檢測有望作為療效監(jiān)測的標(biāo)記物。整體而言，在15例的血漿樣本中，8例檢測特異性寡克隆，這與先前He等人報道的非霍奇金淋巴瘤血漿樣本中的數(shù)據(jù)(8/14)類似[18]。Sarkozy等[19]報道濾泡性淋巴瘤中74%的血漿樣本中檢出特異性寡克隆。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)在存在特異性寡克隆的組織樣本中，克隆指數(shù)顯著高于沒有特異性寡克隆的樣本，表明存在特異性寡克隆的樣本的克隆多樣性較低。這種高克隆低多樣性特征也符合先前T細(xì)胞受體(TCR)研究中的一些報道。Keane等用NGS檢測了92例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中TCR多樣性明顯受限[20]。Liu等[21]檢測的6例濾泡性淋巴瘤的TCR，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中TCR多樣性受限，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表現(xiàn)出高度的寡克隆擴(kuò)增。BCR這種高克隆低多樣性特征，主要是由于特異性寡克隆的高度擴(kuò)增導(dǎo)致的，可能與患者預(yù)后等臨床病理特征相關(guān)。因此，本研究著重分析了組織以及血漿中的克隆指數(shù)、特異性寡克隆數(shù)與Ann Arbor分期、IPI得分、血清LDH水平等臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。盡管組織中克隆指數(shù)與IPI得分有一定的負(fù)相關(guān)，但是并不顯著。之前一些研究也嘗試把IgH重排使用的不同V片段與淋巴血液系統(tǒng)腫瘤的預(yù)后聯(lián)合在一起[22-23]。本研究中由于樣本數(shù)少及生存期等隨訪數(shù)據(jù)的缺失，IgH重排與臨床病理特征的相關(guān)性還有待進(jìn)一步探索。

NGS檢測IgH重排不僅可獲得具體量化的VDJ重排組成，同時可以得到完整的CDR3序列，結(jié)合cfDNA樣本檢測，能實(shí)現(xiàn)對MRD的無創(chuàng)檢測與腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)測。相對于其他一些檢測MRD的方法，比如PET/CT、流式細(xì)胞術(shù)、基于PCR的檢測方法，基于NGS的IgH重排測序的一個重要優(yōu)勢在于擁有更高的檢測靈敏度及更廣泛的應(yīng)用價值[24]。一項研究用基于NGS的IgH重排測序監(jiān)測DLBCL患者的復(fù)發(fā)，發(fā)現(xiàn)91%的一線治療后復(fù)發(fā)患者在臨床影像確診之前都能檢出MRD陽性，并且先于影像學(xué)確診的中位時間達(dá)到3.5個月[25]。

綜上，本研究認(rèn)為用NGS檢測IgH重排可以全面量化評估克隆異質(zhì)性，為成熟B細(xì)胞淋巴瘤的診斷、預(yù)后及治療提供良好的數(shù)據(jù)支持。