智 鵬，楊 波，陳浩然，陳熙勐，遲小華，張鈞棟，郭 斌，李卓陽(yáng)，劉格良，張皓旻，王毅興，盧學(xué)春

2019年12月31日，研究人員在武漢報(bào)道的數(shù)個(gè)不明原因肺炎病例中發(fā)現(xiàn)了一種未知的冠狀病毒，即新型冠狀病毒(2019-novel coronavirus,2019-nCoV)[1]。感染2019-nCoV后，絕大多數(shù)患者初始癥狀多為發(fā)熱、乏力和干咳，引起傳染性疾病-新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)，但目前尚缺乏疫苗，也沒(méi)有特效的抗病毒藥[2]。國(guó)家衛(wèi)健委頒布的診療指南中明確提出，可用α干擾素霧化吸入進(jìn)行抗病毒治療[3]。本研究通過(guò)分析α干擾素抗病毒相關(guān)全基因組表達(dá)譜，探索其對(duì)COVID-19的潛在治療意義。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 本研究以“interferon-alpha”為關(guān)鍵詞在基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus，GEO)進(jìn)行檢索，并以①物種為人；②至少2個(gè)生物重復(fù)；③實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路清晰、數(shù)據(jù)質(zhì)量好為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本研究所使用的數(shù)據(jù)集均為經(jīng)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)處理后的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜矩陣。根據(jù)數(shù)據(jù)來(lái)源實(shí)驗(yàn)描述以及各樣本類型，將數(shù)據(jù)設(shè)定為對(duì)照組與處理組。

1.3 差異表達(dá)基因識(shí)別 在Bioconductor(http://www.bioconductor.org/)網(wǎng)站下載生物信息分析的R語(yǔ)言程序[5]。利用Impute程序包對(duì)已獲取的表達(dá)譜進(jìn)行歸一化處理[6]。同時(shí)利用注釋包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋，將探針對(duì)應(yīng)到基因上，隨后利用Limma程序包以|logFC|>1，F(xiàn)DR<0.05作為閾值篩選處理組與對(duì)照組的差異表達(dá)基因。

1.4 富集分析 利用基因本體學(xué)(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(the kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析[7]。采用Fisher確切概率法，以FDR<0.05，P<0.05作為篩選條件，以獲得差異表達(dá)基因富集的生物學(xué)進(jìn)程(Biological Processes,BP)、細(xì)胞組分(cellular Component,CC)、分子功能(Molecular Function,MF)和KEGG通路。

1.5 構(gòu)建顯著性基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò) 使用STRING開源數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)前述顯著性基因構(gòu)建蛋白質(zhì)互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)[8]。以可靠性閾值大于0.4作為截?cái)嘀挡?shù)據(jù)下載。隨后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape可視化分析軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，去除游離節(jié)點(diǎn)，使用Degree算法評(píng)估網(wǎng)絡(luò)中基因節(jié)點(diǎn)的重要性，選取degree值前十位的基因作為核心基因[9]。

1.6 疾病關(guān)聯(lián)分析 本研究前期基于“系統(tǒng)生物學(xué)”和“比較功能基因組學(xué)”理論設(shè)計(jì)了“整合多組學(xué)分析”算法，并以此為基礎(chǔ)建立了涵蓋所有疾病、9 000多種臨床常用藥物、1 000多種中藥以及近10萬(wàn)種化合物的人體功能基因組學(xué)大數(shù)據(jù)的臨床生物信息學(xué)表觀精準(zhǔn)治療預(yù)測(cè)平臺(tái)(epigenomic precision medicine prediction platform，EpiMed)[10-11]。應(yīng)用該平臺(tái)對(duì)上述差異表達(dá)基因進(jìn)行多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析，尋找α干擾素的適應(yīng)證及為后續(xù)優(yōu)化含α干擾素的新冠病毒病治療聯(lián)合方案提供理論依據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)篩選 共計(jì)檢索出2 478條結(jié)果，根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)在結(jié)果中再次篩選包含α干擾素處理組與對(duì)照組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的全基因組RNA表達(dá)芯片數(shù)據(jù)集。最終選擇并下載符合本研究要求的GSE5542數(shù)據(jù)集。該數(shù)據(jù)集來(lái)源于GPL96平臺(tái)(affymetrix human genome U133A array)。作用對(duì)象為A549細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)條件為：DMEM(西格瑪，圣路易斯，美國(guó))與10%胎牛血清(FBS)(歐米茄科學(xué)公司，圣弗南度谷,加拿大)。將未經(jīng)α干擾素處理組數(shù)據(jù)設(shè)為對(duì)照組，經(jīng)α干擾素處理6 h和24 h的數(shù)據(jù)分別設(shè)為6 h處理組和24 h處理組。

2.2 差異表達(dá)基因識(shí)別 共發(fā)現(xiàn)6 h處理組有311個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)差異表達(dá)基因212個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因99個(gè)；24 h處理組有303個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)差異表達(dá)基因194個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因109個(gè)，圖1。

圖1 差異表達(dá)基因

2.3 富集分析 GO 富集分析結(jié)果顯示，6 h處理組共富集BP 44條，CC 1條，MF 2條，24 h處理組共富集BP 50條，CC 12條，MF 3條，圖2。

圖2 GO富集分析

KEGG通路富集分析顯示，6 h處理組共富集217條KEGG通路，24 h處理組共富集209條KEGG通路(圖3),選取部分通路圖展示，圖4。分別為RIG-I樣受體信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化和人免疫缺陷病毒感染信號(hào)通路圖這些基因在紅色區(qū)域表達(dá)上調(diào)，在綠色區(qū)域下調(diào)。

圖3 KEGG通路分析

圖4 部分信號(hào)通路圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析及核心基因篩選 6 h處理組共得到294個(gè)蛋白，876條相互關(guān)系，平均點(diǎn)度5.96。24 h處理組281個(gè)蛋白，698條相互關(guān)系，平均點(diǎn)度4.97(圖5)，對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的基因進(jìn)行節(jié)點(diǎn)得分計(jì)算，篩選得到排名前10位的核心基因，圖6。

圖5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖6 核心基因

2.5 疾病關(guān)聯(lián)分析 以EpiMed平臺(tái)為依據(jù)，選取結(jié)果中6 h處理組和24 h處理組中與α-干擾素作用負(fù)相關(guān)的疾病和正相關(guān)的藥物，篩選得到疾病和藥物以及匹配靶點(diǎn)。部分結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 EpiMed疾病關(guān)聯(lián)分析

表2 EpiMed藥品關(guān)聯(lián)分析

3 討論

現(xiàn)階段，針對(duì)COVID-19的治療還處于研究階段，α干擾素雖已作為臨床治療的藥物已寫入診療方案并取得初步療效，但其治療機(jī)制尚不明確。本研究應(yīng)用臨床生物信息學(xué)方法，對(duì)α干擾素的藥物功能基因組學(xué)數(shù)據(jù)開展研究，發(fā)現(xiàn)α干擾素發(fā)揮抗病毒作用不僅僅通過(guò)單一靶點(diǎn)或通路發(fā)揮作用，其作用是全基因組范圍的。

本研究發(fā)現(xiàn)，在α干擾素影響的基因中，大量基因與抗病毒有關(guān)，包括IRF7、OASL、ISG15等在內(nèi)的基因已經(jīng)有明確的文獻(xiàn)證實(shí)[12-14]。同時(shí)，還有大量基因與免疫激活、抗炎性反應(yīng)以及抗腫瘤有關(guān)[15]。在信號(hào)通路方面，本研究發(fā)現(xiàn)，α干擾素的作用不僅限于抗病毒，如RIG-1樣受體能識(shí)別病毒核酸成分，此類RIG-I樣受體都定位在細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)上，病毒侵入細(xì)胞后，在酸性環(huán)境中釋放核酸物質(zhì)，進(jìn)而被RIG-I樣受體識(shí)別，發(fā)揮抗病毒作用[16]；α干擾素可通過(guò)對(duì)JAK-STAT受體信號(hào)通路的抑制作用，影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及炎癥等生物學(xué)過(guò)程，推測(cè)在2019-nCoV感染的治療中，α干擾素可能通過(guò)此通路減少正常細(xì)胞的凋亡，減輕對(duì)靶器官的損傷作用[17]。同時(shí)α干擾素還具有抗炎性作用，如Th17細(xì)胞信號(hào)通路，它是一類由原始CD4+T細(xì)胞分化而來(lái)的輔助性T細(xì)胞。Th17細(xì)胞可以分泌多種重要的細(xì)胞炎癥因子，其中最重要的是白介素17(interleukin-17，IL-17)與其受體結(jié)合后可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生IL-8、IL-6和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF、趨化因子CXCL，趨化并激活中性粒細(xì)胞在局部浸潤(rùn)，推測(cè)α干擾素可通過(guò)抑制炎性因子的產(chǎn)生而發(fā)揮對(duì)2019-nCoV感染的治療作用[18]。

利用EpiMed平臺(tái)進(jìn)行多組學(xué)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，α干擾素對(duì)社區(qū)獲得性肺炎等疾病具有治療作用，且潛在治療靶點(diǎn)中有大量基因發(fā)揮了關(guān)鍵作用，如MX1，OASL，ISG15等；同時(shí)，α干擾素針對(duì)膿毒癥等感染性疾病同樣具有潛在治療作用，且治療靶點(diǎn)中存在大量免疫相關(guān)基因[19]，提示α干擾素可通過(guò)影響免疫相關(guān)分子及信號(hào)通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，而2019-nCoV感染可激活先天性和適應(yīng)性的免疫反應(yīng)，但不受控制的先天反應(yīng)和受損的適應(yīng)性免疫反應(yīng)可能導(dǎo)致局部和全身組織損傷[20-21]。不僅如此，還與病毒性疾病、傳染性疾病和退行性關(guān)節(jié)炎等負(fù)相關(guān)，而這些疾病與本次新型冠狀病毒肺炎的臨床病理相似，據(jù)此推測(cè)α干擾素對(duì)COVID-19具有潛在治療作用。在藥物關(guān)聯(lián)分析中，與α干擾素呈正相關(guān)藥物包括利巴韋林、利托那韋、奈韋拉平、西多福韋、氟伐他汀等，在國(guó)家衛(wèi)健委辦公廳最新印發(fā)的診療方案中明確指出：利托那韋和利巴韋林為抗病毒治療藥物，且建議利巴韋林和干擾素聯(lián)合應(yīng)用，與本研究結(jié)果一致。同時(shí)，西多福韋、氟伐他汀等藥物的發(fā)現(xiàn)對(duì)COVID-19的潛在藥物研究具有一定的借鑒意義。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，α干擾素具有抑制炎癥因子產(chǎn)生、免疫調(diào)節(jié)等方面的作用，為其用于COVID-19治療提供了初步的分子機(jī)制認(rèn)識(shí)；篩選出的潛在藥物還有待于體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。