張寧坤，高連如，趙 力，王麗華，朱 瑩，劉秋穎，劉 玲，苗 晨，郝 璐，陳 宇

心肌梗死是心血管疾病中最危急事件[1]。我國(guó)每年新發(fā)急性心肌梗死約100萬(wàn)人，并有低齡化的趨勢(shì)，急性心肌梗死死亡率居高不下，研究心肌梗死病因、病理等發(fā)病機(jī)制，研發(fā)新的治療方法和藥物是心血管疾病領(lǐng)域的重要研究方向。在心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病基礎(chǔ)研究及干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病的基礎(chǔ)研究中，動(dòng)物心肌梗死模型被廣泛應(yīng)用，在其模型制作中由于小鼠繁殖力強(qiáng)、易于飼養(yǎng)、價(jià)格低廉、占用空間少、操作簡(jiǎn)便，小鼠染色體在進(jìn)化的過(guò)程中保留了人類(lèi)同線(xiàn)性基因群，小鼠基因在一定程度與人類(lèi)基因同源性強(qiáng)[2]，通過(guò)小鼠模型可從分子、細(xì)胞、形態(tài)學(xué)、發(fā)育、電生理和行為等多方面研究人類(lèi)病因[3]，因此，在基礎(chǔ)研究中使用小鼠作為動(dòng)物模型也更為廣泛[4-5]。小鼠心肌梗死模型的制作方法有藥物法、電刺激法、電凝燒灼法[6]、冷凍法及冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法，其中冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法是目前實(shí)驗(yàn)中最為常用的心肌梗死造模方法[7]，這種方法可直接造成冠狀動(dòng)脈堵塞，實(shí)驗(yàn)周期短，可以觀察梗死后對(duì)心肌的損害[6]?，F(xiàn)有的操作方式是將小鼠麻醉后氣管插管，機(jī)械輔助通氣，開(kāi)胸后進(jìn)行前降支結(jié)扎。此方法操作環(huán)節(jié)多，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，小鼠胸腔開(kāi)口視野小，心臟搏動(dòng)快，在胸腔內(nèi)進(jìn)針結(jié)扎極易扎到心房，是引起小鼠死亡的最多因素。為解決這一問(wèn)題，本研究對(duì)高效快速制作小鼠心肌梗死模型方法經(jīng)過(guò)深入研究[8]，強(qiáng)化操作技能訓(xùn)練，建立了一套獨(dú)特的快速制作小鼠心肌梗死模型的方法，減少操作環(huán)節(jié)，優(yōu)化流程，為快速大量制作小鼠心肌梗死模型提供了一個(gè)優(yōu)良的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性BALB/c小鼠100只，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)于北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2018-0010。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑和儀器 異氟烷(江蘇恒豐強(qiáng)生物技術(shù)有限公司)，氧氣(北京東方醫(yī)用氣體有限公司)，HE染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，超聲(Vivid7，美國(guó)GE公司)，顯微鏡(CKX-41，日本奧林巴斯公司)，小動(dòng)物心電圖機(jī)(ZS-2000，北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物麻醉 用氣體流量管連接好氧氣、麻醉機(jī)、氣體分流器、麻醉誘導(dǎo)箱，調(diào)整異氟烷的濃度為3%誘導(dǎo)麻醉模式，打開(kāi)分流器將異氟烷與氧氣的混合氣輸入至麻醉誘導(dǎo)箱。每次在麻醉誘導(dǎo)箱中放入5只小鼠，麻醉時(shí)間為1 min，小鼠麻醉后，調(diào)整麻醉機(jī)參數(shù)使異氟烷的濃度為1.5%持續(xù)麻醉模式，再調(diào)整氣體分流器將異氟烷與氧氣的混合氣持續(xù)輸入至麻醉誘導(dǎo)箱和小鼠手術(shù)臺(tái)呼吸面罩，將已經(jīng)麻醉的小鼠從麻醉誘導(dǎo)箱中取出，口鼻放入小鼠手術(shù)臺(tái)上呼吸面罩內(nèi)，小鼠仰臥在手術(shù)臺(tái)，四肢用膠帶固定。

1.2.2 模型制作 小鼠左前胸備皮后碘伏消毒，用10 cm手術(shù)剪在胸骨左緣第3～4肋間胸大肌前沿剪開(kāi)皮膚，開(kāi)口尺寸為0.5～1.0 cm用鑷子夾住皮膚，止血鉗在皮膚下分離胸大肌與皮膚，再用鑷子夾住胸大肌，止血彎鉗探入胸大肌下夾住胸小肌進(jìn)行兩者分離，此時(shí)明顯可見(jiàn)第3～4肋骨，止血彎鉗通過(guò)3～4肋間探入胸腔左右輕輕分開(kāi)肋骨，左手在小鼠體外用拇指抵住小鼠腹腔左上部，中指彎曲抵住小鼠腹腔右側(cè)，食指抵住小鼠胸腔右側(cè)。先輕輕用力反復(fù)擠壓胸腔，待見(jiàn)到心尖部位于胸腔開(kāi)口處時(shí)再同時(shí)擠壓胸腔，配合調(diào)整止血鉗撐開(kāi)肋骨開(kāi)口大小。隨著心臟自主收縮搏動(dòng)，小鼠心臟游離端即可通過(guò)3～4肋間開(kāi)口跳出胸腔。迅速用7-0縫合線(xiàn)平左心耳下緣進(jìn)針，向心臟右側(cè)至肺動(dòng)脈圓錐與心尖部連線(xiàn)處出針，在目視下結(jié)扎前降支，左心室前壁(left ventricular anterior wall，LVAW)心肌顏色變淡，止血鉗再?gòu)男呐K下面探入3～4肋間胸腔開(kāi)口處輕輕撐開(kāi)肋骨。隨著心臟自主收縮，心臟迅速收回到胸腔，左手拇指、食指和中指配合輕輕擠壓胸腔，擠出胸腔內(nèi)空氣，用止血鉗鉗合肋骨，迅速將胸小肌復(fù)位于3～4肋間上，胸大肌覆蓋于胸小肌之上，胸部皮膚切口兩側(cè)鉗夾合攏，用6-0號(hào)線(xiàn)縫合皮膚切口。術(shù)后切口碘伏消毒，脫呼吸面罩，將小鼠置于37 ℃動(dòng)物復(fù)溫電熱毯上。

1.2.3 心電圖檢查 在術(shù)后進(jìn)行心電圖檢查，用針電極刺穿小鼠四肢，電極連接心電圖機(jī)檢測(cè)小鼠心電圖，觀察ST段抬高情況。

1.2.4 超聲檢查 在術(shù)前和術(shù)后2周進(jìn)行超聲檢查。小鼠胸骨左右兩側(cè)皮膚脫毛，使用14.0 MHz高頻超聲探頭檢查小鼠心臟左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室收縮末內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)、左室舒張末內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)及LVAW厚度。

1.2.5 小鼠心肌組織外觀和病理學(xué)檢查 小鼠心肌梗死模型制作2周后處死小鼠，取出心臟，與正常小鼠的心臟對(duì)比觀察心臟前壁外觀情況，經(jīng)冠狀面切開(kāi)小鼠心臟，觀察LVAW厚度。石蠟包埋心臟進(jìn)行病理切片，厚度5 μm，進(jìn)行HE染色，觀察LVAW的病理變化。

2 結(jié)果

2.1 模型制作成功率 100只小鼠前降支結(jié)扎制作心肌梗死模型后，誘導(dǎo)麻醉及持續(xù)麻醉期間小鼠心律、呼吸均正常，無(wú)死亡，術(shù)中無(wú)死亡，術(shù)后2周內(nèi)死亡4只，小鼠心肌梗死模型快速制作后存活率達(dá)96%。經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)，死亡小鼠因心肌梗死面積過(guò)大，導(dǎo)致死亡。而存活小鼠中，2只小鼠超聲心功能檢查及病理檢查未符合心肌梗死表現(xiàn)，心肌梗死模型成功率94%。

2.2 模型制作時(shí)間 本方法開(kāi)胸時(shí)皮膚是實(shí)際剪開(kāi)，在分離胸大肌和胸小肌以及分離肋間時(shí)均是鈍性分離，不進(jìn)行任何剪切，肌肉沒(méi)有機(jī)械損傷，有利于傷口恢復(fù)。術(shù)者通過(guò)熟練的操作手法完成從開(kāi)胸、擠出心臟、結(jié)扎前降支到關(guān)胸的步驟，在(40±10)s內(nèi)完成(圖1)。心臟整體目視下的冠脈前降支結(jié)扎可達(dá)到100%的結(jié)扎率，胸腔開(kāi)放時(shí)間為15～30 s。在關(guān)胸同時(shí)，通過(guò)左手的熟練操作擠壓出胸腔空氣，覆蓋胸小肌、胸大肌及縫合時(shí)保證胸腔負(fù)壓，即刻能恢復(fù)自主呼吸，撤除呼吸面罩后，1 min后即可蘇醒。

圖1 制作小鼠心肌梗死模型操作方法

2.3 心電圖檢查結(jié)果 小鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段明顯抬高，圖2。

圖2 小鼠心肌梗死模型制作后心電圖

2.4 超聲檢查結(jié)果 M型超聲可見(jiàn)，術(shù)前小鼠左室舒縮功能節(jié)律性強(qiáng)，左室壁正常(圖3)。術(shù)后較術(shù)前LVAW出現(xiàn)節(jié)段性運(yùn)動(dòng)減弱或消失，梗死區(qū)域有心肌強(qiáng)回聲，LVAW組織發(fā)生重構(gòu)，舒縮功能減低，左室室壁厚度明顯變薄(圖4)；檢查小鼠心功能LVEF較術(shù)前降低[(27.5±3.9)%，P<0.01]，LVESD較術(shù)前增加[(1.07±0.23)mm，P<0.01]，LVEDD較術(shù)前增加[(1.4±0.29)mm，P<0.01]，LVFS較術(shù)前降低[(8.1±3.1)%,P<0.05]，LVAW較術(shù)前降低[(0.44±0.06)mm，P<0.01(圖5)。

圖3 小鼠心肌梗死模型制作前M型超聲

圖4 小鼠心肌梗死模型制作后M型超聲

圖5 小鼠心肌梗死模型制作前后超聲心功能檢查

2.5 病理檢查結(jié)果 小鼠心肌梗死后心臟整體外觀，前降支結(jié)扎處，LVAW明顯凹陷(圖6A)，正常小鼠心臟整體外觀飽滿(mǎn)圓潤(rùn)(圖7A)；心臟冠狀切面可見(jiàn)模型小鼠LVAW厚度減低，顏色較其他組織變淺(圖6B)，較正常小鼠顯著減低，正常小鼠LVAW組織飽滿(mǎn)(圖7B)。病理檢查HE染色，可見(jiàn)心肌梗死小鼠LVAW出現(xiàn)大量瘢痕組織，顯示心肌梗死后心肌的重構(gòu)(圖6C)，而正常小鼠未見(jiàn)異常(圖7C)。

圖6 模型小鼠心肌梗死組織

圖7 正常小鼠心肌組織

3 討論

制作小鼠心肌梗死模型直接有效的方法是制造冠狀動(dòng)脈前降支狹窄或堵塞，這種方法研究周期短，可以制造一個(gè)比較穩(wěn)定的缺血病變區(qū)，模型制作方便，可重復(fù)性強(qiáng)，效果顯著，符合臨床冠狀動(dòng)脈缺血造成心肌梗死的病理發(fā)生發(fā)展過(guò)程，對(duì)研究心肌梗死的病理機(jī)制和尋求可采取的治療方案實(shí)用性更強(qiáng)，也更貼近臨床[6]。有學(xué)者報(bào)道，如果未造成完全的冠脈堵塞或形成缺血適應(yīng)可影響心肌梗死的形成[9]。因此，冠狀動(dòng)脈徹底結(jié)扎對(duì)制作心肌梗死模型的成功尤為重要。

冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法是目前國(guó)內(nèi)外常用的建立心肌梗死動(dòng)物模型的方法，既往的冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法是經(jīng)肌肉或腹腔注射麻醉藥物，使小鼠持續(xù)麻醉，經(jīng)口氣管插管，呼吸機(jī)輔助呼吸，開(kāi)胸結(jié)扎前降支。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是：小鼠經(jīng)麻醉后可保持持續(xù)麻醉1 h以上，有充足的時(shí)間進(jìn)行術(shù)前準(zhǔn)備和冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎[6]。缺點(diǎn)是：①小鼠的氣管狹窄，在經(jīng)口氣管插管時(shí)對(duì)插管的選擇非常有限，小鼠的插管因?yàn)楦?xì)，研究者多用光滑的細(xì)軟管[10]。在呼吸機(jī)輔助呼吸時(shí)因?yàn)橥鈮毫υ龈邥?huì)導(dǎo)致插管的深部與小鼠氣管密合不嚴(yán)，從而使通氣效率減低，引起小鼠死亡。②開(kāi)胸結(jié)扎的時(shí)候，為保證關(guān)胸后胸腔閉合好，開(kāi)口較小，進(jìn)針易扎到心房或左心耳引起大出血導(dǎo)致小鼠死亡。③呼吸機(jī)輔助呼吸使兩側(cè)肺組織有規(guī)律的膨脹，左肺的膨脹會(huì)擴(kuò)張到胸腔開(kāi)口處，在開(kāi)胸或進(jìn)針結(jié)扎前降支時(shí)極易損傷肺組織，在關(guān)胸后引起氣胸等嚴(yán)重并發(fā)癥，極易導(dǎo)致小鼠的死亡。④肌肉注射麻醉藥物，通常使用速眠新、氯氨酮、水合氯醛、戊巴比妥、戊巴比妥鈉、丙泊酚及甲托咪定[11]等，在手術(shù)操作時(shí)間不穩(wěn)定及小鼠耐受不同的情況下，會(huì)導(dǎo)致麻醉藥物的麻醉效果降低；如果再追加麻醉藥物大多效果不佳。如果追加過(guò)量，手術(shù)后較長(zhǎng)時(shí)間小鼠不易蘇醒，而且由于中樞神經(jīng)的抑制、體溫下降、無(wú)法自主呼吸最終死亡率增高。

本方法將小鼠的心臟擠出胸腔，目視下結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，視野開(kāi)闊目標(biāo)清晰。也有學(xué)者嘗試了這種方法，但操作難度太大，主要是開(kāi)胸和擠出心臟時(shí)方法不正確，時(shí)間較長(zhǎng)，死亡率高[12]。本研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了大量的學(xué)習(xí)和強(qiáng)化訓(xùn)練后，優(yōu)化了操作環(huán)節(jié)，壓縮各步驟的操作時(shí)間來(lái)完成小鼠心肌梗死模型的制作，突出的優(yōu)點(diǎn)是：①在熟練的操作流程下，短時(shí)間內(nèi)完成手術(shù)，不需要?dú)夤懿骞?，麻醉使用異氟烷與氧氣混合氣體經(jīng)呼吸面罩輸送給小鼠進(jìn)行全身麻醉[13]，此麻醉方法與肌肉注射麻醉藥物的方法都是抑制小鼠中樞神經(jīng)達(dá)到麻醉效果，本方法麻醉效率高，給小鼠輸入麻醉混合氣體后，通常在1 min左右迅速達(dá)到麻醉效果，撤除麻醉混合氣體后，小鼠短時(shí)間內(nèi)即解除對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制，很快蘇醒，有時(shí)蘇醒的時(shí)間不會(huì)超過(guò)1 min，避免了小鼠術(shù)后持續(xù)抑制中樞神經(jīng)而引起的一系列后果。②在開(kāi)胸結(jié)扎前降支時(shí)只有皮膚是剪開(kāi)的，其余的肌肉組織分離都是鈍性分離，肋間開(kāi)口能使心臟移出胸腔即可，開(kāi)口不宜過(guò)大，避免了不必要的失血和后續(xù)關(guān)胸不嚴(yán)造成氣胸的嚴(yán)重問(wèn)題，利于傷口愈合和呼吸功能在術(shù)后的迅速恢復(fù)。通過(guò)術(shù)者的熟練操作手法，可迅速將心臟擠壓出胸腔，心臟在胸腔外，肉眼直視可以清晰看到冠狀動(dòng)脈前降支，心臟嵌在胸腔開(kāi)口處更容易被固定，減少快速心律對(duì)心臟位置固定的影響，對(duì)進(jìn)針結(jié)扎前降支及出針位置會(huì)掌握的非常準(zhǔn)確，不會(huì)引起誤扎心房和左心耳導(dǎo)致出血和心律失常等并發(fā)癥的發(fā)生。關(guān)胸時(shí)術(shù)者順勢(shì)擠壓出胸腔氣體，止血鉗閉合兩肋骨迅速覆蓋胸大肌和胸小肌，建立胸腔負(fù)壓，保持小鼠正常呼吸。從止血鉗進(jìn)入胸腔到擠出心臟、結(jié)扎前降支、關(guān)閉胸腔這段操作過(guò)程的時(shí)間只有15～30 s，在胸腔開(kāi)放的過(guò)程中，可以造成小鼠肺不張的情況，因?yàn)樾厍婚_(kāi)放的時(shí)間非常短，不需做其他處理，心臟回復(fù)到胸腔后迅速關(guān)胸腔，關(guān)胸的過(guò)程同時(shí)制造了胸腔的負(fù)壓狀態(tài)，肺不張的情況立即緩解，恢復(fù)正常呼吸。操作過(guò)程中無(wú)因肺不張而導(dǎo)致小鼠呼吸困難和死亡的情況，這是本研究的重點(diǎn)核心步驟，操作過(guò)程幾乎沒(méi)有影響到小鼠的自主呼吸，撤除麻醉后即可蘇醒。

判定小鼠心肌梗死模型是否成功，通常使用超聲或心電圖檢查，為實(shí)現(xiàn)交叉印證心肌梗死情況，可以使用多因素共同判斷，①心電圖判斷，小鼠的心肌梗死心電圖與大鼠類(lèi)似，在心肌梗死模型制作完成后，連接肢體導(dǎo)聯(lián)，2個(gè)或2個(gè)以上相鄰導(dǎo)聯(lián)Q波形成且>1/4R波，寬度>0.04 s，ST段抬高0.2 mV可判定為心肌梗死[14]。②超聲檢查心功能，小鼠體積小，胸壁薄距心臟距離短，要使用高頻探頭進(jìn)行檢查[15]，通常用12～14 MHz超聲探頭，小鼠心肌梗死2周后，梗死部位即發(fā)生心肌組織重構(gòu)，與術(shù)前相比LVEF和LVFS會(huì)明顯減低，LVESD和LVEDD會(huì)明顯增加，LVAW厚度明顯減低、運(yùn)動(dòng)功能明顯減弱。③直觀心肌前壁組織變化，處死小鼠取心臟后，觀察LVAW與正常小鼠的不同，心肌梗死小鼠LVAW凹陷，顏色變白，厚度明顯低于正常組小鼠LVAW認(rèn)為心肌組織已經(jīng)因?yàn)樾募」Ｋ腊l(fā)生嚴(yán)重的心肌重構(gòu)。④病理學(xué)檢查，心肌重構(gòu)的部位心肌細(xì)胞丟失嚴(yán)重，瘢痕組織會(huì)代替丟失的心肌細(xì)胞，失去活力，HE染色可見(jiàn)明顯的瘢痕組織形成，為心肌梗死后心肌重構(gòu)的重要表現(xiàn)。

以本研究方法制作的心肌梗死模型，小鼠死亡率低，成模率高，減少了手術(shù)操作的時(shí)間，可以在短時(shí)間內(nèi)大量迅速制作小鼠心肌梗死模型，提高了大規(guī)模制作小鼠心肌梗死模型進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究的效率。