高 嘯，沈 瑩

糖尿病是一種代謝性疾病，患者長期血糖水平異常偏高，或與高血壓共存，長此以往易造成器官受損、功能障礙或衰竭[1-2]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病嚴重并發(fā)癥之一，約25%糖尿病患者終末期患上腎臟疾病[3]。盡管在DN治療方面取得了進步，但近年來發(fā)病率仍在急劇上升[4]。當前的治療包括控制血壓和血糖、降血脂以及保證腎功能，終末期患者使用透析或腎臟移植治療等。但此類治療僅用于減緩疾病的進展，還需要新的生物標志物和療法以減輕疾病的負擔并控制其他并發(fā)癥。研究表明，高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)、晚期糖基化終產物受體(receptor of advanced glycation endproducts，RAGE)、Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)和核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)的一系列復雜機制在糖尿病慢性炎癥的發(fā)展中起著重要作用[5]。本研究擬觀察DN模型小鼠體內上述幾種蛋白表達情況，進一步探討HMGB1-RAGE/TLRs-NF-κB信號通路中關鍵蛋白與DN的關系。

1 資料與方法

1.1 實驗動物和模型建立 C57BL/6雄性小鼠(8～9周)購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心[SCXK(粵)2008-0002,粵監(jiān)證字2008D007]，適應性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件為12 h光照周期，溫度為(21.0±2.0)℃，相對濕度為50.0%～70.0%，自由進食、水。動物實驗經醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批通過。注射日小鼠禁食禁水4 h，每日靜脈注射鏈脲菌素(STZ，1 g/瓶，北京索萊寶科技有限公司)55.0 mg/kg，連續(xù)5 d，共注射15只。同時給予15.0 g/L蔗糖水48 h。注射完成1周后，檢測空腹血糖，若大于16.0 mmol/L，則視為糖尿病小鼠；糖尿病小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，4周后出現尿蛋白，標志DN模型建立成功[6]。共構建DN模型成功12只，隨機分為DN組和治療組，每組各6只小鼠。用生理鹽水替代STZ以相同方式給予另一批小鼠，作為對照組(共6只)。其中治療組小鼠給予胰島素(國藥準字H10890001，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)皮下注射治療，1/d，每次2.0 U。以造模成功后為第0周，共治療4周。DN組和對照組小鼠注射同等量生理鹽水代替胰島素，注射時間和劑量相同。

1.2 HMGB1拮抗劑A Box對小鼠DN模型的影響將DN組6只小鼠隨機抽取3只給予人重組HMGB1拮抗劑A Box(HMGBiotech Srl公司，意大利)注射，另外3只小鼠以生理鹽水替代A Box注射，每次400.0 μg，每周3次，共處理10周；對照組同樣方法處理。

1.3 樣品收集 DN組于建模完成后1 d、3 d和1周取尾部靜脈血2 mL，治療組控制血糖在10 mmol/L內后1 d、3 d和1周后取尾部靜脈血2 mL，對照組小鼠和DN組同期取1 d、3 d和1周尾部靜脈血2 mL，以檢測相關蛋白和mRNA水平。建模14周后，處死全部小鼠，收集血液用以檢測血糖水平，收集尿液用以對尿白蛋白定量。收集腎臟、脾臟和胰腺組織切片用10%中性緩沖的福爾馬林固定以進行石蠟包埋，冷凍于OCT化合物中或速凍于液氮中以進行mRNA提取。

1.4 指標檢測

1.4.1 小鼠尿白蛋白定量和血糖檢測 使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)定量集(Bethyl Laboratories公司，蒙哥馬利，TX，USA)對白蛋白進行定量。取尾靜脈血使用血糖儀監(jiān)測其含量。

1.4.2 HMGB1-RAGE/TLRs-NF-κB信號通路關鍵蛋白水平檢測 使用ELISA法檢測HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4和NF-κB蛋白水平，試劑盒購于Shino-TestCorporation(日本Kanagawa公司)。利用實時反轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4和NF-κB mRNA水平，所有結果均以2-ΔΔCt法計算和表示[7]。

1.4.3 組織學染色 將固定在福爾馬林中的腎臟切片使用高碘酸-席夫染色(periodic acid-schiff，PAS)和天狼星紅染色(picro sirius red stain，PSR)，全部操作按照試劑盒說明書步驟完成。在PSR染色切片上對腎小管間質膠原進行評估，光鏡下放大切片(×400)，選取連續(xù)20個視野，計算網格中腎小管間質膠原所占的百分比[8]。只計算腎小管間質膠原，排除血管和腎小球。

2 結果

2.1 各組小鼠一般情況比較 與對照組比較，DN組和治療組小鼠體質量、血糖和尿白蛋白定量均明顯增加(t分別為6.782、10.806、9.712，P<0.01；t分別為6.533、3.161、7.208，P<0.01)；與DN組比較，治療組上述各指標均明顯下降(t分別2.324、7.038、2.942，P<0.05)，表1。DN組小鼠PAS染色可見腎小球肥大，系膜細胞增生系膜基質增多增厚，治療組腎小球肥大情況緩解，圖1。

圖1 3組小鼠腎臟腎小管PAS染色(×400)

表1 3組小鼠一般情況比較

2.2 3組小鼠的HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4及NF-κB水平變化 DN組建模完成后1 d、3 d和1周HMGB1、RAGE、TLR4，NF-κB水平均較對照組明顯升高(P<0.05)，治療組小鼠控制血糖在10 mmol/L內后1 d、3 d和1周后的HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4和NF-κB水平均較對照組明顯升高(P<0.05)；與DN組比較，治療組各時間段上述幾種蛋白水平均明顯偏低(P<0.05，表2)。

表2 DN小鼠不同時間點HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4和NF-κB水平變化(μg/L)

建模完成各時間段DN組和治療組HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4和NF-κB mRNA水平均明顯高于對照組(P<0.01)；與DN組比較，治療組各時間段上述幾種mRNA水平均明顯偏低(P<0.05)，表3。

表3 DN小鼠不同時間點HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4和NF-κB mRNA水平變化(2-△△Ct)

2.3 HMGB1對小鼠DN模型的影響 在DN模型小鼠腎小管間質觀察到明顯間質膠原蛋白沉淀，對照組小鼠中未觀察到。給予A Box后，生理鹽水處理小鼠組織學染色無明顯變化(t=0.086，P=0.933)，DN模型小鼠沉淀明顯減少(t=3.014，P=0.013)，表4，圖2。

表4 HMGB1對小鼠DN模型腎小管間質膠原蛋白百分比的影響

圖2 HMGB1 A Box對腎臟腎小管間質的影響(PSR染色×400)

3 討論

糖尿病高血糖導致細胞代謝反應的各種變化，包括活性氧生成的增加和晚期糖基化終產物(advanced glycation end products,AGEs)的形成[9-10]。后者可以與各自的受體(RAGE)相互作用，誘導一系列代謝反應，導致促炎細胞因子的產生和分泌[11-12]。進一步研究發(fā)現，一系列促炎癥介質都與糖尿病的發(fā)病有關，包括腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1b、白細胞介素-8和HMGB1等[13]。HMGB1本身可以通過RAGE、TLR2和TLR4發(fā)出信號，最終導致NF-kB的激活，NF-kB在造血細胞和內皮細胞中誘導白細胞粘附分子的上調和促炎細胞因子和血管生成因子的產生，從而促進炎癥[14]。此外，NF-kB的激活誘導HMGB1受體的表達，增加HMGB1的分泌可介導炎癥和血管生成的放大，并增加與其相互作用的受體的表達，從而形成HMGB1-RAGE/TLRs-NF-κB信號通路。本研究中，通過注射STZ建立DN模型，后通過胰島素治療小鼠模型，發(fā)現DN小鼠腎小球明顯肥大、血糖和尿白蛋白明顯升高，符合模型臨床表現。本研究檢測HMGB1-RAGE/TLRs-NF-κB信號通路中各種關鍵蛋白的表達，結果顯示，DN模型小鼠體內HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4和NF-κB蛋白和mRNA水平均明顯高于對照組(P<0.05)。但DN模型小鼠經胰島素治療后，上述蛋白和mRNA水平均明顯下調，說明在DN中HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4和NF-κB表達均明顯上調，與既往研究結果一致。

另外，本研究驗證了一種假設，即HMGB1可阻斷HMGB1-RAGE/TLRs-NF-κB信號通路中關鍵蛋白的表達從而阻止DN的發(fā)展。先建立DN模型，后給予HMGB1拮抗劑A Box，特異性的拮抗HMGB1與TLRs和RAGE的結合。通過PSR染色觀察了腎小管間隙膠原蛋白沉淀情況。結果顯示，給予HMGB1 A Box后DN小鼠間質膠原蛋白沉淀明顯減少。腎臟受損傷后會形成各種慢性不可逆的改變，腎小管間隙被大量間質膠原蛋白和細胞外基質等替代，終致使間質纖維化，而這種纖維化的程度與范圍均與腎損傷密切相關[15]。因此，HMGB1的拮抗可抑制腎損傷的進一步發(fā)生，也說明HMGB1 A Box為防止DN的發(fā)展提供了重要的保護。

綜上所述，HMGB1-RAGE/TLRs-NF-κB信號通路關鍵蛋白HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4和NF-κB在糖尿病腎病小鼠中表達增高，阻斷HMGB1和RAGE、TLRs結合，能夠阻止DN發(fā)展。