簡(jiǎn)久瑩 張妮 余婷 王笑笑 伍聰聰 徐衛(wèi)衛(wèi) 郭兵 劉麗榮

1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心（貴陽(yáng)550004）；2貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院臨床血液學(xué)教研室（貴陽(yáng)550004）；3貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院輸血科（貴陽(yáng)550002）；4貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省常見慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（貴陽(yáng)550025）

糖尿病是一種臨床上常見的糖代謝障礙性疾病。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟最新報(bào)道，中國(guó)糖尿病患病率為10.9%，糖尿病患者數(shù)量約為1.14億，位居世界第一［1］。糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是其最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，最終發(fā)展至終末期腎衰竭［2］。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）是導(dǎo)致DN腎臟纖維化發(fā)生的機(jī)制之一，其特點(diǎn)是上皮表面標(biāo)志物的丟失，間充質(zhì)標(biāo)志物的獲得和細(xì)胞骨架重塑［3-6］。眾所周知，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是EMT發(fā)生的重要誘導(dǎo)因子［7-8］，但其具體作用機(jī)制仍知之甚少。

研究發(fā)現(xiàn)［9-10］，在TGF-β1誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞中，細(xì)胞外基質(zhì)的沉積與組蛋白H3第4位賴氨酸甲基化（H3K4me）水平增加有關(guān)，可見組蛋白甲基化是促纖維化的一個(gè)關(guān)鍵因素。組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶2（SET and MYND domain containing 2，SMYD2）是一種含有SET結(jié)構(gòu)域的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶。有研究［11］表明，SMYD2在正常腎組織中低表達(dá)，在腎癌組織中高表達(dá)，提示其參與腎癌的發(fā)生發(fā)展。SMYD2在腎囊腫組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，其通過甲基化核轉(zhuǎn)錄因子κB和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3使其磷酸化活化，促進(jìn)囊性上皮細(xì)胞分泌多囊蛋白和炎性細(xì)胞因子，進(jìn)而促進(jìn)囊腫的生長(zhǎng)［12-13］。由此可見SMYD2與腎臟疾病密切相關(guān)，但SMYD2在DN研究領(lǐng)域尚未見報(bào)道。因此，本研究構(gòu)建了DM模型小鼠，探討SMYD2在DM腎組織中的表達(dá)變化，為臨床治療DN提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑蛋白提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物有限公司；STZ（S0130）、α-SMA（A5228）和Vimentin（V5255）購(gòu)自sigma公司；β-actin（bs-0061R）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SMYD2（D14H7）購(gòu)自Cell signaling公司；E-cadherin（20874-1-Ap）購(gòu)自Proteintech公司；TGF-β1（ab92486）購(gòu)自abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組24只無特定病原體（SPF）級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，6周齡，購(gòu)買于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司［許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002］。隨機(jī)將24只小鼠分為正常對(duì)照（NC）組、DM12周組、DM24周組、DM28周組，每組6只。按55 mg/kg劑量腹腔注射鏈脲佐菌素復(fù)制DM小鼠模型，1次/d，連續(xù)注射5 d。48 h后尾靜脈取血測(cè)隨機(jī)血糖，血糖＞16.7 mmol/L且尿糖陽(yáng)性者判定為造模成功，NC組給予相同劑量STZ溶媒。各組小鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，分別于造模后第12周、24周和28周處死DM各組小鼠，于第28周處死NC組小鼠。小鼠處死前6 h禁食不禁水，麻醉后眼球摘除法取血，3 500 r/min離心5 min分離血清，凍存于-80 ℃冰箱保存。將腎組織一分為二，1/2浸泡在含4%多聚甲醛，用于觀察腎組織病理學(xué)改變；另1/2凍存于-80 ℃冰箱，用于相關(guān)蛋白的檢測(cè)。

1.3 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)生化指標(biāo)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組小鼠血糖（blood glucose，BG）、血肌酐（serum creatinine，Scr）和尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。

1.4 HE、Masson 染色觀察腎臟病理學(xué)改變HE染色：將浸泡在含4%多聚甲醛的腎組織進(jìn)行石蠟包埋，再用切片機(jī)制作厚度約為3 μm的石蠟切片，脫水透明后進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行分析。Masson染色：采用Masson三色染色試劑盒對(duì)已制備好的石蠟切片進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行分析。

1.5 Western blot 檢測(cè)腎組織中SMYD2、E-cadherin、α-SMA、Vimentin 和TGF-β1 蛋白水平的變化蛋白上樣工作液的制備：將0.02 g腎組織和200 μL蛋白裂解液置于玻璃勻漿器內(nèi)，研磨后離心，吸出上清液；采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定上清液的蛋白濃度；將一定量蛋白原液和5×蛋白上樣緩沖液按比例制備1×蛋白上樣工作液。Western blot：制備SDS- PAGE凝膠，將制備好的上樣工作液上樣進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉。分別加入一抗：SMYD2（1∶500）、E-cadherin（1∶10 000）、α-SMA（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、TGF-β1（1∶1 000）和β-actin（1∶5 000），4 ℃搖床孵育過夜。取出PVDF膜，室溫孵育二抗1 h，TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。Image J 1.44軟件計(jì)算各條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白與β-actin的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析。P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組小鼠血糖水平生化檢測(cè)結(jié)果顯示：與NC組 相 比，DM12周 組、DM24周 組、DM28周 組BG、Scr和BUN水平均明顯增高（P ＜0.05，表1）。

表1 各組小鼠BG、Scr 和BUN 的變化Tab.1 The results of BG，Scr and BUN in each group ±s

表1 各組小鼠BG、Scr 和BUN 的變化Tab.1 The results of BG，Scr and BUN in each group ±s

注：與NC 相比，*P ＜0.05

組別NC DM12 周DM24 周DM28 周BG（mmol/L）7.42±1.01 31.84±9.54*34.77±3.92*33.63±3.29*Scr（μmol/L）7.80±0.08 9.53±0.33*9.86±1.54*10.13±0.63*BUN（mmol/L）6.80±0.16 8.67±1.96*9.45±0.97*9.64±1.31*

2.2 各組小鼠腎組織病理學(xué)變化HE染色結(jié)果顯示：NC組小鼠腎小球形態(tài)、結(jié)構(gòu)完整，腎小管基底膜完整，上皮細(xì)胞排列整齊，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；DM12周組小鼠的腎組織病理學(xué)改變不明顯；DM24周組小鼠少量腎小球出現(xiàn)系膜細(xì)胞增生，偶見腎小管空泡變性；DM28周組小鼠腎組織中部分腎小球出現(xiàn)系膜細(xì)胞增生，且有少量基底膜增厚，腎間質(zhì)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分腎小管發(fā)生顆粒變性和空泡樣變（圖1）。Masson染色結(jié)果顯示：NC組小鼠腎間質(zhì)無纖維增生；DM12周組小鼠腎間質(zhì)纖維增生不明顯，DM24周組小鼠腎間質(zhì)出現(xiàn)少量纖維增生，DM28周組小鼠纖維增生程度明顯（圖1）。

2.3 各組小鼠腎組織中E-cadherin、α-SMA、Vimentin 的蛋白水平變化與NC組相比，DM組小鼠E-cadherin蛋白在12周時(shí)表達(dá)下降不明顯，在24周和28周時(shí)明顯下降，α-SMA、Vimentin蛋白在一直維持在較高水平（P ＜0.05，圖2）。

圖2 Western blot 檢測(cè)小鼠腎組織E-cadherin、α-SMA 和Vimentin 蛋白水平Fig.2 Detection of E-cadherin，α-SMA and Vimentin protein expression in renal tissue of mouse by Western blot

圖1 HE 和Masson 染色示各組小鼠腎組織形態(tài)學(xué)變化（400×）Fig.1 Histological change of kidney tissue in each groups by HE and Masson staining（400×）

2.4 各組小鼠腎組織中SMYD2、TGF-β1 蛋白表達(dá)變化與NC組小鼠相比，DM組SMYD2蛋白表達(dá)逐漸增加（P ＜0.05）；TGF-β1在NC組有少量表達(dá)，DM組從24周開始可見TGF-β1蛋白表達(dá)明顯增加（P ＜0.05，圖3）。

圖3 Western blot 檢測(cè)小鼠腎組織SMYD2、TGF-β1 蛋白水平Fig.3 Detection of SMYD2、TGF-β1 protein expression inrenal tissue of mouse by Western blot

2.5 相關(guān)性分析SMYD2與E-cadherin的蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（r =-0.846），與α-SMA、Vimentin和TGF-β1的蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)（r = 0.601，P ＜0.05；r=0.608，P ＜0.05，r=0.769，P ＜0.05）。

3 討論

有研究［14］表明腎小管上皮細(xì)胞EMT在DN腎臟纖維化中扮演了重要的角色，其特點(diǎn)是上皮表面標(biāo)志物的丟失，間充質(zhì)標(biāo)志物的獲得和細(xì)胞骨架重塑。除此之外，眾多研究者發(fā)現(xiàn)應(yīng)用多種藥物或細(xì)胞因子抑制腎小管上皮細(xì)胞EMT能有效減輕DN腎臟纖維化［15-18］。這些研究背景表明了EMT在DN腎臟纖維化中占據(jù)重要地位。在本實(shí)驗(yàn)研究中，HE染色結(jié)果顯示DM小鼠在24周和28周時(shí)腎臟病理學(xué)改變較為明顯，Masson染色結(jié)果顯示DM小鼠在24周和28周時(shí)腎間質(zhì)有纖維沉積，并且上皮表面標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)明顯下降，間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA、Vimentin蛋白表達(dá)明顯增加，表明小鼠發(fā)生了EMT。TGF-β1主要通過激活Smad信號(hào)通路誘導(dǎo)EMT的發(fā)生［19-21］，同時(shí)也可激活其它非Smad信號(hào)通路來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，DM小鼠腎組織TGF-β1蛋白水平表達(dá)明顯增加。

越來越多的研究表明，組蛋白甲基化在腎臟疾病中發(fā)揮了重要的作用。LIU等［22］研究結(jié)果顯示，在單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）誘導(dǎo)腎臟纖維化小鼠模型和TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L表達(dá)增加，H3K79me2水平增加，給予高選擇性的DOT1L抑制劑EPZ5676干預(yù)可以緩解小鼠腎臟纖維化、腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT和肌成纖維細(xì)胞活化。SASAKI等［23］研究顯示，在UUO小鼠中，TGF-β1通過Smad3途徑誘導(dǎo)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SET7/9表達(dá)上調(diào)，應(yīng)用siRNA SET7/9和其抑制劑sinefungin干預(yù)后能改善UUO小鼠的腎臟纖維化。ZHOU等［24］研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Zeste homolog-2（EZH2）和H3K27me3在UUO小鼠腎組織和TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中高表達(dá)，用EZH2抑制劑3-deazaneplanocin A和siRNA EZH2干預(yù)后可以減輕小鼠腎臟纖維化和腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。因此組蛋白甲基化在腎臟纖維化中占據(jù)重要地位。本研究發(fā)現(xiàn)SMYD2在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DM小鼠腎組織中高表達(dá)，DM28周時(shí)蛋白水平增加尤為明顯。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，SMYD2與E-cadherin呈明顯負(fù)相關(guān)，與α-SMA和Vimentin呈明顯正相關(guān)，以上結(jié)果足以說明SMYD2是DM小鼠腎臟發(fā)生EMT的關(guān)鍵分子，且SMYD2與TGF-β1的蛋白表達(dá)呈明顯正相關(guān)，提示本模型中SMYD2高表達(dá)可能與TGF-β1有重要聯(lián)系，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)DM小鼠模型中，腎組織SMYD2表達(dá)上調(diào)，推測(cè)其可能和TGF-β1表達(dá)上調(diào)共同參與EMT的發(fā)生，進(jìn)而參與調(diào)控DN的發(fā)生發(fā)展。然而在DN的發(fā)展過程中，SMYD2和TGF-β1之間到底有何聯(lián)系以及其表達(dá)的上調(diào)還受哪些因素的影響有待進(jìn)一步研究證實(shí)。