張海燕，陳光輝，張秀英，王玉濤

(1.喀什大學生命與地理科學學院，新疆喀什，844000；2.新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點實驗室， 新疆喀什，844000；3.喀什海關(guān)技術(shù)中心，新疆喀什，844000)

0 引 言

【研究意義】葉蟬屬于半翅目，頭喙亞目(Auchenorrhyncha)，角蟬總科(Membracoidea)，葉蟬科(Cicadellidea)[1]。該科昆蟲分布廣泛，全世界約1 500屬，超過22 000種，中國約2 000種[2]。葉蟬屬持久型傳毒介體[3]，是一類對農(nóng)林業(yè)威脅較大的害蟲，可傳播植物病毒病，如稻普通矮縮病、小麥紅矮病、玉米線條病毒(由異沙葉蟬持久傳播[4])等。對有害昆蟲來說，種類鑒別、防控與監(jiān)測尤為重要[5]，若不能及時準確鑒定而影響相應(yīng)防治措施的采取，會對生態(tài)環(huán)境造成潛在的威脅[6]。葉蟬科昆蟲有些類群形態(tài)相似，體色相當，在農(nóng)林業(yè)害蟲管治中，物種鑒定一直是制約生產(chǎn)的瓶頸[7]；有些體型和體色等特征易隨發(fā)育階段或地理環(huán)境的改變而改變[8]，遺傳結(jié)構(gòu)也會改變[9]，如額垠葉蟬屬Mukaria[10]，增加了鑒定難度。葉蟬科昆蟲高齡若蟲較低齡若蟲傳病力強，成蟲較若蟲傳病力強[3]，低齡葉蟬在若蟲期較易防治，但該蟲體型微小，幼蟲形態(tài)特征差異小，有些特征在不同發(fā)育時期不穩(wěn)定，對幼蟲、蛹及卵采取形態(tài)鑒定法很難確保其準確性[11]。形態(tài)分類法受蟲態(tài)、發(fā)育階段、地理環(huán)境等影響，非專業(yè)人員很難快速、準確鑒定。DNA條形碼技術(shù)能夠克服形態(tài)學分類的不足，實現(xiàn)不同發(fā)育歷期、不同形態(tài)、殘體昆蟲的快速準確鑒定。Hajibabaei 等[12]用DNA條形碼技術(shù)對哥斯達黎加的鱗翅目3個科幼蟲進行了有效識別，江亞杰等[13]用此技術(shù)對7種儲糧害蟲碎片進行了準確鑒定。研究選用線粒體基因?qū)υ搮^(qū)域的葉蟬進行分類鑒定，這對邊境生物安全具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】1993年Fang[14]首次將16SrDNA運用于角頂葉蟬的系統(tǒng)發(fā)育研究中，日本昆蟲學家Kamitani[15]利用COI基因?qū)θ毡?5種葉蟬做了條形碼研究；Dietrich等[16]應(yīng)用28SrDNA序列探討了角蟬總科的系統(tǒng)發(fā)育；美國國立生物技術(shù)信息中心共收錄了該科42種葉蟬線粒體基因組數(shù)據(jù)，其中27種測定了全序列。李虎等[17]用COI基因?qū)V頭葉蟬亞科進行研究，發(fā)現(xiàn)序列A+T含量明顯高于G+C。付建玉等[18]基于mtDNA COI，開展假眼小綠葉蟬研究，發(fā)現(xiàn)該種葉蟬種群間遺傳距離為0.5%～1.2%，遠小于2%的界限。楊金宏等[19]基于28SrDNAD2區(qū)，開展陜南凹緣菱紋葉蟬分子系統(tǒng)學與遺傳多樣性研究，孟澤洪等[20]基于Cytb基因序列，探討大葉蟬亞科部分種類分子系統(tǒng)學，何宏力[21]開展了窗翅葉蟬分子系統(tǒng)學研究，詹洪平[22]通過分子技術(shù)和形態(tài)學結(jié)合的方法對圓痕葉蟬進行分析，確定了系統(tǒng)發(fā)育樹中各屬、種的地位。前人選擇這些基因研究葉蟬，提供了DNA條形碼，明確了葉蟬系統(tǒng)進化地位或分類地位，但是集中于COI基因，對Cytb、ITS2等基因的研究較少；我國目前對葉蟬的條形碼研究尚不夠全面，特別是帕米爾高原地區(qū)新的分類階元有待發(fā)現(xiàn)?！颈狙芯壳腥朦c】葉蟬科昆蟲種類豐富，數(shù)量龐大，可傳播植物病毒病，對農(nóng)林業(yè)危害極大，有效防治較為困難，準確鑒定是有效防治的基礎(chǔ)。由于該科昆蟲體型小，種間形態(tài)相似，難以鑒定，帕米爾高原南麓山地區(qū)域葉蟬分布較多，已成為影響農(nóng)林生產(chǎn)的害蟲之一，而此地區(qū)有關(guān)葉蟬研究報道較少，帕米爾高原與阿富汗、巴基斯坦等國接壤，外來物種入侵時有發(fā)生，區(qū)域內(nèi)對昆蟲研究較少，葉蟬條形碼研究鮮有報道。通過傳統(tǒng)形態(tài)分類法，確定未知葉蟬的大致類群，選擇mtDNACOI、Cytb和ITS2基因，運用通用引物PCR擴增并直接測序，借助生物信息學分析軟件對比分析目的基因序列的相似性，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析遺傳進化關(guān)系，獲取葉蟬DNA條形碼，實現(xiàn)不同種類葉蟬的快速鑒定?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究利用DNA條形碼技術(shù)，采用傳統(tǒng)分類和分子生物學相結(jié)合，建立葉蟬快速鑒定方法，以彌補形態(tài)學分類的不足，豐富邊境地區(qū)葉蟬基因數(shù)據(jù)庫。

1 材料與方法

1.1 材 料

葉蟬樣本于2019年6～9月，用捕蟲網(wǎng)掃捕掃獲得。在實驗室進行形態(tài)學分類，獲取試驗標本7份，標記為A、B、C、D、E、F、G，將標本置于99%酒精離心管中，于4℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆?。?

體視顯微鏡(Motic Cam2506 SMZ168)、PCR儀(Biometra TProfessional standard Gradient Thermocycler)、高速低溫離心機(BECKMAN COULTERTM AllegraTM X-22R Centrifuge)、電泳儀(JY1600C)、水平電泳槽(美國Bio-Rad)、凝膠成像儀(Bio-Rad Molecular Imager Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng))、振蕩器(IKA MS3 digital)、恒溫水浴鍋等。

1.2 方 法

1.2.1 基因組 DNA 的提取

DNA提取參照鄒志文等[23]Chelex改進方法，首先雙蒸水清洗樣品數(shù)次(期間漩渦振蕩)，將清洗好的樣品置于潔凈濾紙上干燥，挑取單頭樣品置于1.5 mL的離心管中，用滅菌玻璃研磨棒充分研磨；加滅菌雙蒸水0.5 mL，渦漩混勻，置冰箱-20℃冷卻10 min，12 000 r/min離心5min，棄上清，重復3次；在沉淀中加入150 μL懸浮好的5%的Chelex-100溶液，56℃水浴2 h；渦旋5～10 s，100℃加熱10 min(封口)，取出后渦旋溶液5～10 s，10 000 r/min離心5 min，取上清作為PCR反應(yīng)的模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因PCR 擴增

引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成。擴增體系總體積為25 μL，其中Taq酶1.5 U，dNTP 0.25 mmol/L，1×反應(yīng)緩沖液2.0 mmol/L Mg2+，上下游引物各為0.3 μmol/L，DNA 模板50 ng。反應(yīng)步驟為：95℃預變性5 min，95℃變性45 s，56℃退火35 s，72℃延伸1.5 min，循環(huán)40次，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。表2

表1 葉蟬樣本采集信息Table1 Sample information collected in this study

表2 PCR 擴增引物設(shè)計及其參考文獻Table 2 PCR primer design and its reference

1.3 數(shù)據(jù)處理

測序所獲得的基因序列用Dnastar Package中的Editseq軟件進行正反鏈拼接匹配校正，獲得有效序列。在NCBI網(wǎng)站運行BLAST程序進行序列同源性比較，確定為昆蟲的COI、Cytb、ITS2序列。利用GenBank中下載的36條同源序列，用ClustalX 1.83軟件進行比對。用MEGA7.0分析堿基組成、變異位點，各種間序列差異，計算核苷酸組成?；贙imura-2-Parameter模型，用NJ(Neighbour-Jioning)法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，采用自展法重復檢測1 000次，循環(huán)估計系統(tǒng)樹中節(jié)點的自舉置信水平(bootstrap confidence level，BCL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 采集標本所屬類群的鑒定

研究表明，參照葉蟬科成蟲的形態(tài)特征進行鑒定，觀察外部形態(tài)，采集樣品隸屬于半翅目葉蟬科，分別為A：條沙葉蟬(Psammotettixconfinis)、B：廣頭葉蟬(Pediopsoides)、C：條沙葉蟬(Psammotettixconfinis)、D：大青葉蟬(Cicadellaviridis)、E：片角葉蟬(IdiocerusurakawensisMatsumura)、F：桃一點葉蟬(Singaporashinshana)、G：擬菱紋葉蟬(Hishimonoidesrecurvatis)。表3

表3 6種葉蟬樣本成蟲鑒定形態(tài)特征Table 3 Morphological characteristics for identification of 6 kinds of adult Cicadellidaes

2.2 葉蟬的ITS2、Cytb、COI 序列

研究表明，獲得葉蟬核酸序列共19條， 其中COI基因6條、Cytb基因7條、ITS2基因6條，上述19條核酸序列中12條序列為研究首次獲得。將所測序列進行拼接校對，在NCBI 網(wǎng)站上運行BLAST 程序，所測序列與昆蟲的COI、Cytb、ITS2基因有很高的相似性，測定序列為COI、Cytb、ITS2基因序列。與 GeneBank中的相關(guān)基因序列進行比較，結(jié)合 GeneBank 中下載的與該COI、Cytb、ITS2序列一致性較高的葉蟬的序列，用 ClustalX1.83 軟件進行比對，將非保守區(qū)域去除。

7個樣品的Cytb序列AT含量分別為72%、73%、74%、74%、75%、73%、69%；6種樣品COI序列的AT含量分別為70%、69%、69%、70%、66%、70%，COI、Cytb基因的AT含量高于GC，表現(xiàn)出A+T堿基偏嗜，且A與T含量相當，契合昆蟲線粒體基因堿基組成特點。所得COI、Cytb基因序列均能在分子水平上進行監(jiān)測分析。表4

2.3 葉蟬分子鑒定

研究表明，ITS1、ITS2相似度大于97%、Cytb,COI相似度大于98%視為相似度達到物種鑒定標準或水平[42]。研究獲得7個COI基因序列中，有5個樣品與GenBank中相關(guān)序列相似度高達99%，大于或等于鑒定水平98%，可以鑒定為該類昆蟲，其中樣品A、C與KR564712.1條沙葉蟬PsammotettixconfinisCOI基因的相似度分別為99.67%、99.49%，為條沙葉蟬；樣品D與MF716879.1 大青葉蟬CicadellaviridisCOI基因的相似度為99.32%，為大青葉蟬；樣品F與KJ867504.1桃一點葉蟬SingaporashinshanaCOI基因的相似度為99.68%，為桃一點葉蟬；樣品G與KY364883.1擬菱紋葉蟬HishimonoidesrecurvatisCOI基因的相似度為99.38%，為擬菱紋葉蟬。樣品D與GenBank中HQ456379.1 大青葉蟬CicadellaviridisCytb基因的相似度為99.54%，確定為大青葉蟬；樣品F與NCBI中 KJ867509.1桃一點葉蟬SingaporashinshanaCytb基因的相似度為99.58%，為桃一點葉蟬；單個序列或多個序列的鑒定結(jié)果是一致的，每個樣品都進行了準確鑒定，與形態(tài)鑒定結(jié)果一致，樣品D與F 的Cytb基因序列進一步佐證了鑒定結(jié)果的準確性。樣品B與E與數(shù)據(jù)庫中相關(guān)條形碼的相似度存在一定差距，未達到鑒定標準，不能確定其種類，需要通過其他基因序列進一步鑒定。表5

表4 mtDNA核苷酸組成統(tǒng)計Table 4 Nucleotide composition statistics

表5 葉蟬鑒定依據(jù)和鑒定結(jié)果 Table 5 Identification basis and identification results

2.4 葉蟬系統(tǒng)進化

研究表明，每個基因最高得分的最高相似度分別為：COI(99.68%)、Cytb(99.58%)、ITS2(95.92%)，結(jié)果顯示均和葉蟬相關(guān)序列的相似性最高。研究選擇了mtDNACOI、Cytb，核基因ITS2等3個基因片段研究葉蟬DNA 條形碼，但因數(shù)據(jù)庫中Cytb、ITS2基因序列數(shù)據(jù)較少，影響Cytb、ITS2相似度和遺傳距離分析，故只闡述COI基因序列。構(gòu)建COI葉蟬部分屬種NJ分子系統(tǒng)樹，研究樣品的COI序列和葉蟬類昆蟲相關(guān)序列分為5個進化支，且和已知葉蟬S.zeamais相關(guān)序列以較高置信值聚在一起，其中樣品A、C與條沙葉蟬聚為1支，樣品D與大青葉蟬聚為1支，樣品F與桃一點葉蟬聚為1支，樣品G與擬菱紋葉蟬聚為1支，將5種葉蟬準確區(qū)分開來。圖1

注：圖中數(shù)字表示置信度；樣本用實心菱形標出Note:Integer indicates bootstrap confidence values, and sample is marked in solid diamond圖1 與葉蟬相關(guān)的部分種類的 COI基因NJ 分子系統(tǒng)樹Fig.1 COI gene NJ phylogenetic tree of partial species related to Cicadellidaes

3 討 論

3.1 葉蟬DNA條形碼基因堿基組成特征

研究7個樣品的COI、Cytb序列A+T含量明顯高于G+C，與田小娟對花蝽科昆蟲的COI序列的研究結(jié)果一致，花蝽科序列T+ A含量為66.07%，存在 A/T 偏倚性，符合昆蟲線粒體基因序列堿基組成特點[5]；與陳壯志等[43]對蜚蠊的Cytb序列的研究結(jié)果一致，蜚蠊A+T含量為69.5%，高于G+C含量，為典型的動物線粒體基因序列特征；章旭日等[44]研究福建小貫小綠葉蟬ITS序列發(fā)現(xiàn)，該類葉蟬ITS2 A+T占65.1%，堿基組成呈AT偏好性，與親緣種的比較分析顯示ITS2更適用于近緣種的分子鑒定[44]。相關(guān)研究表明，ITS2基因A+T含量占60%以上時，存在AT堿基偏嗜。研究中ITS2基因A+T含量未達到60%，與前人研究結(jié)果不一致，可能與ITS2更適用于近緣種的分子鑒定，該研究中葉蟬樣品與數(shù)據(jù)親緣關(guān)系較近有關(guān)；有研究表明，G+C含量與核苷酸替代率成反比[45]，研究中葉蟬ITS2 G+C含量較高，也可能與該區(qū)域核苷酸替代率較慢有關(guān)。但與李艷華[46]28S rDNA對槳角蚜小蜂和食蚧蚜小蜂的研究結(jié)果一致，兩者G+C含量分別為60.3%、58.8%，均高于A+T的含量[46]，說明葉蟬rDNA基因較保守。Leo等用ITS2基因研究人體寄生虱序列時發(fā)現(xiàn)，ITS2不適合作為寄生虱的分子標記[47]，因此，僅由單一序列得到的結(jié)論可能存在片面性，物種的鑒定應(yīng)該從形態(tài)、生境、分子生物學等方面綜合分析[48]。

3.2 葉蟬DNA條形碼基因的序列相似度

Cytb,COI相似度大于98%視為相似度達到物種鑒定標準或水平[42]。ITS1、ITS2 基因在NCBI中的相似度為 96%～97%，相似度相對較低，但也能有效鑒定物種[49]。對達到鑒定標準的鑒定到種，未達到標準的認定為新序列。單個樣品COI、Cytb、ITS2序列均為單個同一樣品獲得，在COI獲得鑒定結(jié)果時，其他序列雖未達到鑒定標準，也應(yīng)為該葉蟬序列。Cytb、ITS2序列相似度低于鑒定水平，數(shù)據(jù)庫中關(guān)于該種葉蟬的Cytb、ITS2序列不全面，研究獲得的序列可作為新序列，例如樣品ACOI(99.67%)=Cytb(79.75%)=ITS2(86.87%)，COI已獲得鑒定，Cytb、ITS2序列作為樣品A的序列，未達到鑒定要求，認定為樣品A的新序列。同理，樣品C獲得Cytb、ITS2新序列各1條；樣品F獲得ITS2新序列1條；樣品G獲得ITS2、Cytb新序列各1條；樣品B獲得Cytb、ITS2新序列2條；樣品E獲得COI、Cytb、ITS2新序列3條。研究共獲得新序列12條，Cytb、ITS2新序列較多，COI新序列較少，獲得的新的序列有助于后續(xù)利用Cytb、ITS2序列快速鑒定，同時也說明Cytb、ITS2基因序列有待進一步補充完善。

3.3 葉蟬DNA條形碼基因系統(tǒng)發(fā)育

從NJ分子系統(tǒng)樹看出研究葉蟬樣品COI序列分為5支，和已知的葉蟬S.zeamais相關(guān)序列以較高置信值聚在一起。樣品A、C與條沙葉蟬親緣關(guān)系較近，樣品D與大青葉蟬有親緣關(guān)系較近，樣品F與桃一點葉蟬親緣關(guān)系較近，樣品G與彎莖擬菱紋葉蟬親緣關(guān)系較近。A、C位于NJ樹底端，與位于頂端的D親緣關(guān)系最遠，分別聚為1大支(D、F聚為1大支，G與A、C聚為1大支。)F與G位于NJ樹中端，親緣關(guān)系較近，但分別聚為一大支；D和F親緣關(guān)系最近，聚為一大支，NJ樹種間親緣關(guān)系與形態(tài)分類結(jié)果一致。樣品E與片角葉蟬親緣關(guān)系較近，但NJ樹置信度不高，可能受帕米爾高原區(qū)域生態(tài)環(huán)境、氣候條件影響，與已知數(shù)據(jù)庫中葉蟬種類分子結(jié)構(gòu)有差異。

在葉蟬分子鑒定過程中，可能存在偏差，推測一方面是因帕米爾高原南麓地區(qū)生態(tài)環(huán)境、氣候條件較特殊，區(qū)域內(nèi)相關(guān)昆蟲研究較少，導致GenBank數(shù)據(jù)庫中葉蟬所屬種的序列不全，沒有足夠的、豐富的數(shù)據(jù)進行物種條碼比對[50]，相似度低；另一方面部分未經(jīng)分類學家鑒定，而存在形態(tài)鑒定不準的序列可能被提交到Gen Bank中，造成分類地位可能不準確[51]，存在鑒定誤差，在這種情況下，僅依靠DNA序列比對進行分子鑒定存在風險[52]。形態(tài)鑒定和分子鑒定相結(jié)合，才能提高速率，若研究對象是未知物種，需權(quán)威專家對該物種進行形態(tài)鑒定，對標本鑒定后獲得的數(shù)據(jù)才會對物種的界定更有參考價值。關(guān)于形態(tài)鑒定，由于各種葉蟬成蟲形態(tài)特征差異不顯著，需從成蟲的翅膀、顏色、觸角、脛足、單復眼、生殖器等部位全面細致觀察，若無成蟲標本，則需捕捉成蟲制成標本。

4 結(jié) 論

確定了mtDNACOI、Cytb及ITS2基因序列可作為葉蟬的DNA條形碼，COI基因6條、Cytb基因7條、ITS2基因6條；其中1條COI序列，5條Cytb序列，6條ITS2序列。

通過mtDNA序列對比、遺傳距離分析、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，得出葉蟬的mtDNA基因序列符合昆蟲的mtDNA序列特征，確定了研究樣品的種類，與形態(tài)鑒定吻合，獲得的基因序列可作為葉蟬的DNA條形碼，確定該區(qū)域4種葉蟬快速鑒定的DNA條形碼。

對7份葉蟬樣本進行了形態(tài)和分子鑒定，其中5分樣本準確鑒定，帕米爾高原南麓有至少4種葉蟬存在。