王 勇，孫 鋒，蘇來曼·艾則孜，李玉玲，伍國紅，駱強(qiáng)偉，郭平峰

(新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所,新疆鄯善 838200)

0 引 言

【研究意義】葡萄是重要的果樹樹種，其栽培面積和產(chǎn)量位居水果第二[1]，葡萄產(chǎn)業(yè)在我國的果樹上占有重要的位置[2]。我國葡萄種質(zhì)資源豐富，國家果樹種質(zhì)鄭州圃、山西圃、左家圃收集保存國內(nèi)外野生資源、地方品種、育成品種等各類葡萄種質(zhì)資源3 395份次。我國自20世紀(jì)50、60年代起至今累計培育出葡萄品種(系)200多個[3]。目前對葡萄等非主要農(nóng)作物品種關(guān)注不夠[4]。開展品種鑒定與譜系分析方法研究，對種苗認(rèn)證、品種登記和植物新品種保護(hù)有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】果樹傳統(tǒng)的種質(zhì)資源的鑒定方法有形態(tài)學(xué)、孢粉學(xué)、細(xì)胞學(xué)[5]、同工酶[6]等，這些方法因受環(huán)境、品種或技術(shù)等方面的影響，不能快速、準(zhǔn)確、有效地完成品種資源間的鑒定[5,6]。TP-M13-SSR(simple sequence repeat with tailed primer M13)技術(shù)是結(jié)合熒光測序技術(shù)與SSR標(biāo)記技術(shù)開發(fā)的SSR擴(kuò)增產(chǎn)物熒光測序檢測技術(shù)，其檢測結(jié)果重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高、且操作程序簡單，是種質(zhì)資源鑒定的最簡單、有效的方法[7]。目前已應(yīng)用在葡萄[8-10]、蘋果[6,11-14]、梨[15-17]、桃[5]、櫻桃[18]、棗[19,20]、杏[21]、核桃[22]等果樹的指紋圖譜構(gòu)建和親緣關(guān)系分析中，提高了品種資源的鑒定能力，加強(qiáng)了品種知識產(chǎn)權(quán)的保護(hù)。【本研究切入點(diǎn)】目前研究培育出了新郁、新雅、新葡1號、火州紫玉等多個品種(系)，其中一些品種已開展了大面積推廣，但到目前為止還未曾利用分子手段開展譜系分析與品種保護(hù)方面的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究以自育的19個品種(系)葡萄為試材,基于TP-M13-SSR技術(shù)，構(gòu)建指紋圖譜，并編碼建立種質(zhì)分子身份證，為苗木認(rèn)證、新品種登記及保護(hù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 葡萄品種(系)譜系

試驗于2019年5～12月在新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所分子實(shí)驗室和葡萄制干鮮食兼用品種改良課題實(shí)驗室進(jìn)行。19份葡萄品種(系)材料均取自新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所葡萄資源圃。表1

表1 19個葡萄品種(系)譜系Table 1 The genealogy of 19 grape varieties (lines)

1.1.2 引 物

選用16對SSR標(biāo)記引物。其中，VVS2、SCU06、VVMD5、VVMD6、VVMD7、VVMD27、VRZAG29、VRZAG62、VRZAG79等9對引物為國際通用葡萄SSR引物[7]，VCHR15a，VCHR13a，VCHR4a，VRZAG67，VMC7H3，SCU15vv，UDV-088等7對引物為前期工作篩選出的具有較高多態(tài)性信息量(PIC)的引物。引物均由北京擎科生物技術(shù)公司合成，每對引物F序列的5’端進(jìn)行FAM熒光標(biāo)記修飾。表2

1.2 方 法

1.2.1 葡萄基因組DNA的提取

參照CTAB改良法[23]提取葡萄試材基因組DNA；通過瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的試材基因組DNA的濃度和純度；將DNA溶液分為2份，1份放入攝氏度-20℃冰箱里長期保存，1份放入攝氏度4℃冰箱備用。

1.2.2 反應(yīng)體系

使用PCR反應(yīng)體系為：2×TaqMix酶10 μL，SSR雙引物混合液(10 μM/mL)0.8 μL，模板(20 ng/μL)2.0 μL，dd H2O 7.2 μL，總反應(yīng)體系為20 μL，PTC-100型PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。擴(kuò)增程序參照王勇等[23]的方法，在操作中根據(jù)各引物差異進(jìn)行體系優(yōu)化。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的檢測

利用2%的瓊脂糖凝膠對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行水平電泳檢測，若有擴(kuò)增結(jié)果不理想的，需要進(jìn)行補(bǔ)充，由生物技術(shù)公司通過毛細(xì)管電泳檢測產(chǎn)物片段種類和大小。

表2 16對葡萄SSR標(biāo)記引物序列及其熒光標(biāo)記Table 2 Sequences and labeled fluoresce of 16 SSR primers

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用PowerMarker v3.25 軟件計算等位基因個數(shù)、 基因型個數(shù)、 等位基因頻率，依據(jù)所得的等位基因頻率，計算各標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(PIC)，公式：

Pij是第i個標(biāo)記位點(diǎn)的第j個等位基因的頻率。

數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理參考陳昌文等[5]的方法。根據(jù)每對引物對不同種質(zhì)擴(kuò)增片段對應(yīng)的分子量大小，按從小到大依次編碼為 1～8。若引物擴(kuò)增的某一品種有 2 個等位基因時，選擇條帶小的編碼賦值。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA質(zhì)量檢測

研究表明，基因組 DNA片段完整，濃度很高，能夠做模版，開展PCR擴(kuò)增。圖1

圖1 試材基因組DNA提取電泳檢測Fig. 1 Results of genomic DNA electrophoresis of the materials

2.2 PCR產(chǎn)物毛細(xì)管電泳

研究表明，4對引物擴(kuò)出了7個多態(tài)性基因片段，4對等位基因型，其中VVS2擴(kuò)增的基因為純合等位基因，SCU06、VVMD5、VMC7H3為雜合等位基因，4對引物的2次擴(kuò)增結(jié)果均存在輕微差異，試驗的擴(kuò)增體系和毛細(xì)管電泳結(jié)果良好。圖2～5，表3

表3 4對引物對新郁重復(fù)擴(kuò)增的毛細(xì)管電泳檢測Table 3 The detection results of repeated amplification of Xinyu with 4 pairs of primers

圖2 引物SCU06對新郁葡萄重復(fù)擴(kuò)增的毛細(xì)管電泳檢測圖譜Fig. 2 The detection pattern of repeated amplification of Xinyu grape by SCU06 primer

圖3 引物VVS2對新郁葡萄重復(fù)擴(kuò)增的毛細(xì)管電泳檢測圖譜Fig. 3 The detection pattern of repeated amplification of Xinyu grape by VVS2 primer

圖4 引物VVMD5對新郁葡萄重復(fù)擴(kuò)增的毛細(xì)管電泳檢測圖譜Fig. 4 The detection pattern of repeated amplification of Xinyu grape by VVMD5 primer

圖5 引物VMC7H3對新郁葡萄重復(fù)擴(kuò)增的毛細(xì)管電泳檢測圖譜Fig. 5 The detection pattern of repeated amplification of Xinyu grape by VMC7H3 primer

2.3 16對SSR標(biāo)記PCR擴(kuò)增

研究表明，利用16對SSR標(biāo)記引物對19份葡萄種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增，共有69個等位位點(diǎn)，擴(kuò)增出105個等位基因，平均每個SSR引物有6.56對等位基因，平均每個 SSR 位點(diǎn)有 4.31 個。擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小的變幅為109～252 bp，每個位點(diǎn)的基因型個數(shù)變幅為4(VrZAG29)～16(VRZAG67)。16 對引物中擴(kuò)增出等位位點(diǎn)數(shù)最多的是VRZAG67，最少的是VrZAG29、SCU15vv和VCHR13a；多態(tài)性信息指數(shù)(PIC)變化范圍為0.28～0.92，平均為0.72；其中引物VRZAG67的 PIC 值最高為0.92，引物 VrZAG29 的 PIC 值最低為0.28。多態(tài)性信息指數(shù)(PIC)是用來衡量 SSR 引物多態(tài)性高低的一個重要指標(biāo)。按照衡量基因變異程度高低的PIC指標(biāo)(>0.5 時，為高度多態(tài)性信息引物；在0.25～0.5時，為中度多態(tài)性信息引物；<0.25 時，低度多態(tài)性信息引物)，篩選出的 16 對 SSR 引物，除VrZAG29外，均為高度多態(tài)性引物。15 對SSR引物能以較高的信息量反映出葡萄品種的基因型多樣性水平，可以用于遺傳多樣性水平分析。表4

表4 16對SSR標(biāo)記引物擴(kuò)增Table 4 The statistics of amplification results of 16 pairs of SSR marker primers

2.4 19個葡萄品種(系)的指紋條帶

研究表明，每個品種在16個位點(diǎn)上均有純合等位基因和雜合等位基因2種類型，其中新葡1號的純合等位基因最高，12個位點(diǎn)為純合等位基因，比率為75%，SP275居第2，有11個，火州紫玉第3。新雅的雜交等位基因最高，15個位點(diǎn)為雜交等位基因，比率為93.75%，新郁、紫霞居第2，均為14個，SP522、SP137、居第3，均為13個。VRZAG79、VVMD27 2對引物擴(kuò)增條帶幾乎相同，可能為同一基因位點(diǎn)。SP4614具有3個特異等位基因(VVS2-143、SCU06-177、VVMD7-250)，SP6164、SP8028、SP10140各具有一個特異等位基因(分別為VVMD7-242、VRZAG79-182、VrZAG62-191)。表5～7

表5 19個葡萄品種(系)的指紋條帶Table 5 The fingerprint bands of 19 grape varieties (lines)

表6 19個葡萄品種(系)的指紋條帶Table 6 The fingerprint bands of 19 grape varieties (lines)

表7 16對葡萄SSR標(biāo)記引物對19個葡萄品種(系)擴(kuò)增的等位基因雜合度Table 7 The statistics of allele heterozygosity of 19 grape varieties (lines) amplified by 16 pairs of SSR marker primers

2.5 構(gòu)建19個自育葡萄品種(系)指紋圖譜

研究表明，16對引物中擴(kuò)增最多的等位基因數(shù)為8，故賦值范圍為1～8。取位點(diǎn)小的進(jìn)行分子編碼，給分子身份證字符串的每位上賦予1個字符。對19份供試葡萄品種進(jìn)行分子編碼，用選取的 5對引物可以將19個品種(系)進(jìn)行有效區(qū)分。選擇多態(tài)性信息較高的引物5對，構(gòu)建指紋圖譜。表8～10

表8 16對葡萄SSR標(biāo)記引物對19個葡萄品種(系)擴(kuò)增結(jié)果Table 8 The amplification results of 19 grape varieties (lines) with 16 pairs of SSR marker primers

表9 19個葡萄品種(系)的指紋圖譜Table 9 The fingerprint of 19 grape varieties (lines)

表10 SSR引物組合對葡萄品種(系)的區(qū)分Table 10 Differentiation of grape varieties (lines) by SSR primer combinations

按照引物多態(tài)性信息量(PIC)的高低順序?qū)ζ贩N進(jìn)行區(qū)分，引物VRZAG67(PIC為0.92)能夠區(qū)分SP137、SP10140 2個品系，VRZAG67+VVS2可以區(qū)分9個品種(系)，VRZAG67+VVS2+SCU06仍是區(qū)分9個品種(系)，VRZAG67+VVS2+SCU06+VVMD7可以分區(qū)13個品種(系)，VRZAG67+VVS2+SCU06+VVMD7+VCHR4a可以分區(qū)17個品種(系)，VRZAG67+VVS2+SCU06+VVMD7+VCHR4a+VCHR15a仍是分區(qū)17個品種(系)，最后在增加引物VVMD5才能將紫霞和新雅區(qū)別開來，這說明紫霞與新雅的親緣關(guān)系很近。第3對引物SCU06和第6對引物VCHR15a在19個品種(系)的區(qū)分上，沒有實(shí)際意義，按照最簡原則，將兩者去除，最終5對引物能夠?qū)崿F(xiàn)19個品種(系)的鑒別，使用5位數(shù)進(jìn)行數(shù)字編碼賦值。表11

表11 19個葡萄品種(系)分子身份證編碼Table 11 Molecular ID code of 19 Variety (line)

3 討 論

SSR標(biāo)記是一種既具有高穩(wěn)定性又具有高準(zhǔn)確性的分子標(biāo)記[24]，在果樹品種資源鑒定中具有重要的應(yīng)用價值。在蘋果上，張春雨等[11]采用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建了新疆野蘋果核心種質(zhì)。金萬梅等[12]利用SSR標(biāo)記開展了蘋果矮化砧木SH系鑒定，探明了7 份SH系的“同物多名”、“異物同名”問題。高源等[6,14]利用3對TP-M13-SSR標(biāo)記完成了國家果樹種質(zhì)興城梨、蘋果圃保存的 131 份蘋果地方品種、育成品種及其野生近緣種區(qū)分，利用6對TP-M13-SSR標(biāo)記完成了314份來自19個國家的蘋果栽培品種的區(qū)分。在梨上，張東等[15]利用6對SSR引物對 29個砂梨品種或類型做了親緣關(guān)系分析。高源等[16]利用SSR熒光標(biāo)記構(gòu)建中國建國以后選育的92個梨品種指紋圖譜，為品種鑒別提供依據(jù)。魯敏等[17]采用10對EST-SSR 引物和9個果實(shí)品質(zhì)性狀指標(biāo)對收集的220份野生刺梨資源的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。在桃上，陳昌文等[5]利用8對SSR標(biāo)記核心引物構(gòu)建了173份中國桃主要品種資源及其野生近緣種的分子身份證。在櫻桃，艾呈祥等[18]構(gòu)建了24個甜櫻桃主要栽培品種SSR指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。在棗上，麻麗穎等[19]利用12對SSR引物構(gòu)建了36份棗品種SSR指紋圖譜，為棗樹分類、種質(zhì)鑒定和分子育種提供了重要的工具。王斯琪等[20]用SSR標(biāo)記進(jìn)行棗樹子代自然授粉實(shí)生苗父本鑒定。在杏上，劉娟等[21]利用4對ISSR引物構(gòu)建了48個新疆主栽杏品種(系)指紋圖譜庫。在核桃上，周貝貝等[22]采用表型性狀和 SSR 標(biāo)記的方法建立核桃親子鑒定方法。在葡萄上，王慧玲等[9]利用9對國際通用SSR標(biāo)記引物構(gòu)建了13個中國葡萄優(yōu)新品種的分子身份證。馬亞茹等[10]開發(fā)了葡萄無核性狀的SSR分子標(biāo)記VvSD10，這將對葡萄雜種后代進(jìn)行早期無核性狀鑒定，為分子標(biāo)記 輔助育種奠定基礎(chǔ)。郭大龍等[8]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了48份葡萄核心種質(zhì)。利用16對SSR標(biāo)記引物研究了19個自育葡萄品種(系)基因型和遺傳多樣性，從中篩選出5對核心引物構(gòu)建了指紋圖譜和分子身份證。

9對國際通用SSR標(biāo)記引物[7]除VRZAG29外均能在19份實(shí)驗材料中表現(xiàn)較高的PIC值，前期篩選的7對引物也均表現(xiàn)出了較高的PIC值，其中VRZAG67的為0.92，高于任何國際通用SSR標(biāo)記引物的。為實(shí)現(xiàn)利用最少引物組合，區(qū)分最多材料的目的，文中按照PIC值高低選擇SSR標(biāo)記引物開展19份品種材料鑒定，發(fā)現(xiàn)SCU06在新葡1號、紫霞、新雅、火州紅玉、火州黑玉、SP522、SP122、SP8028、SP891、SP115等10份材料上不存在多態(tài)性，VCHR15a在紫霞、新雅等2份材料上不存在多態(tài)性，最終篩選出了5對SSR標(biāo)記。其中VRZAG67、VCHR4a為自選引物，VVS2、VVMD7、VVMD5為國際通用引物。這說明國際通用引物不是萬能的，在一些近緣品種間的高效鑒定時存在局限性。

葡萄是一種具有高度雜合性的果樹樹種[25]。文中16對SSR標(biāo)記引物在19個品種(系)中擴(kuò)增出了不同類型的基因型，出現(xiàn)了較高比率的雜合等位基因型，比如，新雅的為15/16、新郁和紫霞均為14/16，但也出現(xiàn)了一些純合比率較高的類型，比如新葡1號為12/16、SP275為11/16，但這些基因型均表現(xiàn)為純合與雜交的混合類型，這體現(xiàn)了葡萄的雜合特性。

4 結(jié) 論

采用16對SSR標(biāo)記引物研究了19個自育葡萄品種(系)基因型和遺傳多樣性，從中檢測出69個等位位點(diǎn)，105個等位基因，并認(rèn)為新雅、新郁、紫霞等3個品種雜合度相對較高，新葡1號，SP275等2個品種(系)相對純合度較高，但均為雜合類型品種(系)。

從16個SSR標(biāo)記引物篩選出5對多態(tài)性信息量相對較高的引物，完成了19個品種(系)的鑒定，構(gòu)建指紋圖譜，并編碼賦值，形成了分子身份識別碼，為品種(系)間的鑒定與區(qū)分提供了依據(jù)。但由于葡萄種質(zhì)共有上千余份，構(gòu)建的種質(zhì)分子身份證已經(jīng)有5位，如果繼續(xù)對更多的品種構(gòu)建分子身份證，需要增加 SSR 引物數(shù)量，增加分子身份證的位數(shù)。