祁 芳，李艷玲，艾 坤*，蔡 雄，李 鑫，劉 梨，楊茜蕓

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙410208，2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410007）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種病因不明、發(fā)病率高、致殘率高的慢性自身免疫性疾病[1]，治療棘手。中醫(yī)針灸治療RA 歷史悠久、療效甚佳，因此，RA 的疾病發(fā)展機(jī)制以及針灸治療RA的干預(yù)機(jī)制持續(xù)成為了醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。 現(xiàn)有的研究證實(shí)，人體內(nèi)核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB） 炎性通路的激活在RA 的發(fā)生發(fā)展中有著至關(guān)重要的作用[2]。 本實(shí)驗(yàn)以NF-κB 信號(hào)通路為切入點(diǎn)，通過(guò)電針佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠模型，在證實(shí)電針抗炎作用的基礎(chǔ)上，通過(guò)檢測(cè)大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞胞漿內(nèi)NF-κB 信號(hào)通路上游的前信號(hào)因子IκB 的磷酸化水平，進(jìn)一步揭示電針可能的抗炎機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供的SPF 級(jí)雄性SD 大鼠70 只，體質(zhì)量（100±15） g，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(湘)2013-0005，在條件適宜的SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)1 周后，用電子秤測(cè)量每只大鼠體質(zhì)量，根據(jù)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行體質(zhì)量的分層(10 g 一分層)，挑選體質(zhì)量為（130±15） g 的大鼠納入實(shí)驗(yàn)，體質(zhì)量偏輕或偏重者剔除，最終保留60 只體質(zhì)量均勻的大鼠，然后將不同體質(zhì)量層次的大鼠隨機(jī)分至正常組、模型組、甲氨蝶呤組（MTX 組）和電針組，每組15 只。

1.2 主要試劑與儀器

礦物油(湖南惟世爾科技有限公司)；滅活結(jié)核桿菌(美國(guó)Difco 實(shí)驗(yàn)室)；異氟烷(上海佳行股份有限公司)；AIMS 型動(dòng)物紋身儀(深圳Reward 公司)；RWD510 型小動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)(山東格萊特股份有限公司)；移液槍(杭州雷琪實(shí)驗(yàn)器材有限公司)；Hamilton 250 μL 型微量注射器(北京Bloning 有限公司)；足腫測(cè)量?jī)x(MGO37140 UGO Basile)；bt701-1b 型電針治療儀(蘇州醫(yī)療用品廠制造)。

1.3 佐劑制備[2]

高溫滅菌后的干燥研缽置于精密天平上準(zhǔn)確稱取結(jié)核桿菌15 mg；用移液槍精密吸取礦物油12 mL加入研缽中充分研磨，直至礦物油清亮無(wú)明顯懸浮雜質(zhì)；將研磨好的MT 懸浮液移入EP 管中，經(jīng)震蕩儀混合均勻后，稀釋、分裝，配備成濃度為1.25 mg/mL的MT 懸浮液（以上操作均在通風(fēng)櫥中進(jìn)行）。

1.4 AA 大鼠模型制備[2]

用小動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)將大鼠淺麻醉完畢后，將大鼠取出并固定，以酒精棉擦拭大鼠尾根部，并在尾根部皮下注射0.1 mL 佐劑，出針、按壓片刻，造模完成。

1.5 模型制備成功的標(biāo)志[3]

正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)，相較于正常組大鼠而言，致炎大鼠從第3 天開(kāi)始逐步出現(xiàn)炎性相關(guān)的癥狀，例如皮溫升高、尾部破潰等；隨著時(shí)間的推延，癥狀持續(xù)加重，第9～12 天，造模后的大鼠（模型組為甚）出現(xiàn)明顯致炎癥狀：皮毛散亂、皮溫升高、體質(zhì)量減輕且尾部多處潰爛，足爪各關(guān)節(jié)有不同程度的腫脹，以上現(xiàn)象提示造模成功。

1.6 取穴與治療方法

取穴定位方法：參照“十三五”國(guó)家規(guī)劃統(tǒng)編教材《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜定位及擬人對(duì)照法定位[4]。 足三里：位于小腿外側(cè)，膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm；關(guān)元：從胸劍聯(lián)合至恥骨聯(lián)合上緣以松緊帶平均分為13 等份（每一等分模擬大鼠同身寸一寸），關(guān)元為恥骨聯(lián)合上緣3 寸；阿是穴：取關(guān)節(jié)周圍腫脹嚴(yán)重部位。（1）電針組[5]：用剃毛器將電針組每只大鼠的關(guān)元、兩側(cè)足三里及其附近的毛發(fā)清理，從造模后的第1 天起在每日的上午9～11點(diǎn)進(jìn)行治療。 將大鼠固定后，以半寸毫針刺于兩側(cè)足三里、關(guān)元穴以及1 個(gè)阿是穴，深度3 mm 左右。 每只大鼠接兩組電針：“足三里(左)+關(guān)元穴”“足三里(右)+阿是穴”為一組，設(shè)置疏密波，頻率為20/50 Hz，緩慢調(diào)節(jié)電流，以針身輕顫為宜，每次治療時(shí)間持續(xù)20 min，7 次/療程，共治療3 個(gè)療程21 d；（2）MTX組：MTX 灌胃治療，劑量為0.35 mg/kg，2 次/周，共給藥3 周；（3）正常組與模型組不作干預(yù)。

1.7 觀測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.7.1 體質(zhì)量 大鼠分組后立即對(duì)所有大鼠進(jìn)行編號(hào)，隨后用電子稱測(cè)量并記錄每只大鼠的體質(zhì)量作為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，在造模后的第12、15、18、21 天的同一時(shí)間點(diǎn)以同樣的方式對(duì)大鼠進(jìn)行體質(zhì)量檢測(cè)和記錄，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共記錄5 次體質(zhì)量的檢測(cè)。

1.7.2 足爪容積的測(cè)量 大鼠分組后在其踝關(guān)節(jié)外側(cè)進(jìn)行紋身標(biāo)記(該標(biāo)記持續(xù)存在，無(wú)需重復(fù)打點(diǎn))，隨后檢測(cè)初始的足爪容積，在此基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)期間大鼠足爪容積的檢測(cè)時(shí)間與體質(zhì)量的測(cè)量時(shí)間一致，共記錄5 次足爪容積的測(cè)量。

1.7.3 關(guān)節(jié)炎評(píng)分[6]該項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)價(jià)依賴對(duì)大鼠的耳部、尾部以及四肢各大、小關(guān)節(jié)進(jìn)行仔細(xì)觀察，本研究中大鼠從造模的第12 天起，出現(xiàn)肉眼可觀察到的致炎反應(yīng)，因此，評(píng)分操作亦自第12 天開(kāi)始，并依次在造模后第15、18、21 天，對(duì)大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分。 具體評(píng)分細(xì)則為：0 分，無(wú)關(guān)節(jié)紅腫；1 分，小趾關(guān)節(jié)的紅腫；2 分，足趾關(guān)節(jié)與小趾關(guān)節(jié)均有腫脹；3 分，踝關(guān)節(jié)以下的足趾關(guān)節(jié)及小趾關(guān)節(jié)腫脹；4 分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪的腫脹。每只大鼠四肢均進(jìn)行評(píng)分，將四肢分?jǐn)?shù)累積，累積分?jǐn)?shù)越高則提示炎癥越嚴(yán)重。 最高分累計(jì)為16 分。

1.7.4 踝關(guān)節(jié)HE 染色及Western-Blot 檢測(cè) 造模后第22 天結(jié)束實(shí)驗(yàn)并取材，將大鼠用10%的水合氯醛麻醉后沿膝關(guān)節(jié)處離斷后爪，全部大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)用于HE 染色，右側(cè)踝關(guān)節(jié)用于檢測(cè)踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞胞漿中IκB 磷酸化水平及其重要相關(guān)蛋白NF-κB 的含量。（1）踝關(guān)節(jié)HE 染色檢測(cè)：大鼠后爪浸泡、固定、脫鈣、沖洗、脫水、透明、浸臘、包埋、冷卻，再固定、切片、展片、撈片、烤片、染色、脫水、透明、封片觀察。（2）小動(dòng)物手術(shù)器械完整剝離關(guān)節(jié)滑膜組織行Western-blot 檢測(cè)：第一步，進(jìn)行蛋白提?。坏诙?，進(jìn)行蛋白含量測(cè)定；第三步，進(jìn)行Western-blot操作，包括電泳、轉(zhuǎn)膜、經(jīng)孵育/曝光和圖片分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)完成后所得數(shù)據(jù)均由SPSS 19.0 進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“±s”表示，并進(jìn)行正態(tài)性與方差齊性分析，對(duì)非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以秩和檢驗(yàn)分析，正態(tài)分布且方差齊性者用LSD 方法，正態(tài)分布但方差不齊者用多元方差分析方法。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

致炎的大鼠先后出現(xiàn)納差、少動(dòng)、情緒激惹、皮毛松散等現(xiàn)象，以模型組最明顯。 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果：（1）體質(zhì)量：造模后的第12、15、18、21 天分別對(duì)大鼠進(jìn)行體質(zhì)量的測(cè)量，與正常組比較，模型組體質(zhì)量顯著減輕（P＜0.01），電針組、MTX 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，電針組、MTX 組大鼠的體質(zhì)量在以上時(shí)段的測(cè)量中均顯著高于模型（P＜0.05）。 （2）足爪容積：對(duì)各組大鼠第12、15、18、21 天足爪容積測(cè)量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析：與正常組比較，模型組存在明顯腫脹（P＜0.01），電針組亦存在腫脹（P＜0.05）；與模型組比較，MTX 組大鼠足趾關(guān)節(jié)的腫脹顯著減輕（P＜0.01），電針組腫脹程度亦有減輕（P＜0.05）。 （3）關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分：自造模后的第12、15、18、21 天分別進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分。數(shù)據(jù)分析顯示：與正常組比較，模型組、電針組的關(guān)節(jié)炎評(píng)分均存在顯著性差異（P＜0.01）；與模型組比較，電針組關(guān)節(jié)炎指數(shù)則明顯低于模型組（P＜0.05）。 見(jiàn)圖1。

2.2 各組大鼠關(guān)節(jié)病理檢查結(jié)果

HE 染色結(jié)果顯示，正常組大鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完好，骨骼線清晰，關(guān)節(jié)間隙適中，滑膜生長(zhǎng)正常；模型組大鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)有明顯的改變，關(guān)節(jié)間隙明顯狹窄，關(guān)節(jié)滑膜增生和骨質(zhì)破壞嚴(yán)重；另一方面，與模型組比較，MTX 組與電針組大鼠的踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)保留較為完整，受破壞程度較輕，而MTX 組的大鼠踝關(guān)節(jié)破壞情況較電針組輕。 見(jiàn)圖2。

2.3 滑膜細(xì)胞胞漿內(nèi)IκB、PIκB 及胞核內(nèi)NF-κB含量比較

與正常組比較，模型組大鼠細(xì)胞胞漿內(nèi)的IκB顯著低于正常組（P＜0.01），磷酸化的IκB（P-IκB）以及胞核內(nèi)NF-κB 則顯著高于正常組（P＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠細(xì)胞胞漿內(nèi)IκB 含量與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），P-IκB 含量則低于模型組（P＜0.05），而胞核內(nèi)NF-κB 亦低于模型組（P＜0.01）。 見(jiàn)圖3-4。

圖1 各組大鼠一般情況比較

圖2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)HE 染色病理切片結(jié)果比較（HE，×40）

圖3 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞胞漿內(nèi)IκB、PIκB，胞核內(nèi)NF-κB 比較

圖4 各組IκB、PIκB、胞核內(nèi)NF-κB、β-actin 電泳圖

3 討論

已有研究證實(shí)[7-8]，NF-κB 對(duì)RA 的發(fā)生和發(fā)展主要體現(xiàn)在：一方面某些炎癥因子例如TNF-α 的存在，會(huì)刺激和啟動(dòng)NF-κB 進(jìn)行強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)，促成多種細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子的過(guò)度表達(dá)，使炎癥反應(yīng)迅猛而廣泛，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生過(guò)度；且過(guò)度增生的滑膜組織亦將分泌多種炎性介質(zhì)，反作用于NF-κB，使炎性反應(yīng)更為強(qiáng)烈而形成正向循環(huán)，推動(dòng)炎癥的惡化發(fā)展，使滑膜增生進(jìn)一步加重；另一方面是活化的NF-κB 通路對(duì)滑膜細(xì)胞的凋亡起重要的抑制作用。對(duì)滑膜細(xì)胞凋亡起抑制作用的凋亡抑制蛋白c-IAP1 和c-IAP2 在NF-κB 被激活后，也會(huì)相應(yīng)升高表達(dá)水平，阻止滑膜細(xì)胞進(jìn)行正常的凋亡程序，導(dǎo)致滑膜細(xì)胞擁有腫瘤細(xì)胞的繁殖特性。 在過(guò)度增生和凋亡抑制的雙重作用下，滑膜組織最終入侵關(guān)節(jié)和骨組織，導(dǎo)致疼痛、關(guān)節(jié)變形、喪失勞動(dòng)能力。

本實(shí)驗(yàn)研究選擇電針大鼠足三里、關(guān)元和阿是穴，主要基于中醫(yī)學(xué)對(duì)RA 的認(rèn)識(shí)和研究[9]，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為RA 屬“痹癥”，其病因包括“外因”和“內(nèi)因”兩個(gè)部分，“外因”指“濕邪、風(fēng)寒、居住不良、勞役過(guò)度、起居不節(jié)等”，而“內(nèi)因”分為“先天享賦不足”和“后天之氣不足”兩方面，歷代醫(yī)家對(duì)RA 的治療均遵循了“扶正祛邪”的基本原則。 足三里為足陽(yáng)明之脈的合土穴，可調(diào)理脾胃、補(bǔ)益氣血生化之源、固護(hù)后天之本。關(guān)元穴為任脈與足三陰經(jīng)交會(huì)穴，有培腎固本、補(bǔ)益精血、調(diào)理沖任、固護(hù)先天之本的功效；另外，通過(guò)刺激阿是穴可以疏通經(jīng)絡(luò)，刺激氣血運(yùn)行，充分發(fā)揮經(jīng)絡(luò)的治療作用，達(dá)到緩解疼痛、改善癥狀的目的。 另外，從分子生物學(xué)角度也證實(shí)[10-11]：電針能夠確切改善RA 病情的確和干預(yù)NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)系，然而具體的干預(yù)環(huán)節(jié)的研究仍不夠深入和具體，其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究和探討。

相關(guān)文獻(xiàn)資料表明[12]：細(xì)胞胞漿內(nèi)的IκB 主要作用是抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活，在正常情況下IκB 通常和NF-κB 蛋白結(jié)合成無(wú)活性的復(fù)活體，防止NF-κB 蛋白進(jìn)入胞核內(nèi)進(jìn)行復(fù)制后激活該炎性通路。 另外，即便有部分NF-κB 蛋白進(jìn)入胞核內(nèi)，IκB在一定程度上亦能對(duì)該蛋白的活動(dòng)起到抑制作用[13]。因此，一旦機(jī)體由于某種原因?qū)е翴κB 磷酸化，IκB蛋白將迅速被水解，從NF-κB 與IκB 復(fù)合體上脫落，解除了抑制的NF-κB 則迅速進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與相應(yīng)的κB 位點(diǎn)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，從而啟動(dòng)一系列炎癥相關(guān)反應(yīng)。由此可見(jiàn)，NF-κB 信號(hào)通路能夠被激活，與IκB 的磷酸化有著密切聯(lián)系：P-IκB 在細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)低者，胞核內(nèi)NF-κB 表達(dá)量也低；而P-IκB 表達(dá)越高者，則胞核內(nèi)NF-κB 的表達(dá)也相應(yīng)高。 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果亦證實(shí)了該理論。

本研究的結(jié)果表明，NF-κB 信號(hào)通路在模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞內(nèi)得到高度激活，而電針組以及MTX 組中大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞內(nèi)該信號(hào)通路得到良性的調(diào)控，因其胞漿內(nèi)的IκB 磷酸化水平均較模型組低，表明電針治療對(duì)抑制IκB 的磷酸化有較為明顯的作用，從一定程度上抑制了NF-κB 信號(hào)通路的活化，從而抑制關(guān)節(jié)滑膜的增生增殖，減輕炎癥反應(yīng)，遏制類RA 的發(fā)生發(fā)展。 綜上，降低滑膜細(xì)胞胞漿內(nèi)IκB 磷酸化水平，良性調(diào)控機(jī)體內(nèi)NF-κB 這一炎癥信號(hào)通路，是電針有效對(duì)抗炎癥、治療RA 疾病的機(jī)制之一。