聶娟　魯珍娥　易家玲　柳威　朱玉婷

摘 要：本文在簡要論述干粉培養(yǎng)基相關(guān)理論知識的基礎(chǔ)上，深入探討了干粉培養(yǎng)基研制的材料與工藝方法，并對其研制結(jié)果進行深入探討，給出了干粉培養(yǎng)基研制與工藝優(yōu)化的實驗結(jié)論，最后將干粉培養(yǎng)基的研制工藝帶入實際應用，綜述了干粉培養(yǎng)基的實踐應用價值和前景展望，旨在為我國干粉培養(yǎng)基研制水平的不斷提高和應用價值的進一步凸顯提供更多參考與啟迪。

關(guān)鍵詞：干粉培養(yǎng)基;研制;應用價值

目前，不論是生物學界還是醫(yī)學界，所使用的培養(yǎng)支原體培養(yǎng)基絕大部分是以美國學者所發(fā)明的肉湯或瓊脂為基礎(chǔ)的干粉培養(yǎng)基，且英國、美國、日本等諸多發(fā)達國家已然將干粉培養(yǎng)基商業(yè)化和工業(yè)化，為工業(yè)生產(chǎn)做出了不可忽視的重要貢獻。我國20世紀50年代初，上海生物制藥品所就開始生產(chǎn)與不斷應用干粉培養(yǎng)基。就現(xiàn)階段而言，國內(nèi)生產(chǎn)干粉培養(yǎng)基往往采用高溫烘干后再球磨的方式，實際生產(chǎn)質(zhì)量較為不穩(wěn)定，產(chǎn)量受生產(chǎn)工藝限制有所缺憾。在此背景下，對干粉培養(yǎng)基的研制研究也就具備了重要理論意義和現(xiàn)實價值，能有效改善我國當前干粉培養(yǎng)基研制效率、生產(chǎn)效率不高的不良狀況，不斷優(yōu)化干粉培養(yǎng)基的研制工藝流程，從而為干粉培養(yǎng)基的商業(yè)化和工業(yè)化提供一定技術(shù)支撐。

1 干粉培養(yǎng)基概述

干粉培養(yǎng)基主要是指將培養(yǎng)基的各種成分經(jīng)過一定的化學處理或物理處理，將培養(yǎng)基實際配方中所需的各種成分以一定量充分混合攪勻，使培養(yǎng)基配方呈現(xiàn)粉末狀態(tài)，并提取此時充分混合的粉末狀態(tài)，按照一定比例加入蒸餾水后熔化，分裝滅菌后即可投入工業(yè)生產(chǎn)的培養(yǎng)基種類。整體而言，干粉培養(yǎng)基生產(chǎn)具備工藝標準化，節(jié)約培養(yǎng)基單個制造時間，且實際生產(chǎn)質(zhì)量較為穩(wěn)定等諸多優(yōu)勢，是適用于一般流動性及其設(shè)備簡單的小型化學實驗室使用的重要培養(yǎng)基類別之一，受到了諸多小型實驗室的強烈歡迎，也為小型實驗室實驗的正常推進做出了重要貢獻。我國從21世紀50年代初期著手研制干粉培養(yǎng)基，干粉培養(yǎng)基在現(xiàn)代醫(yī)藥單位已廣泛投入使用，無菌干粉培養(yǎng)基甚至列入了我國相關(guān)標準規(guī)程。

2 干粉培養(yǎng)基的研制與工藝優(yōu)化

2.1 材料與方法

在干粉培養(yǎng)基的研制與工藝優(yōu)化過程中，本文選擇血清干粉培養(yǎng)基的生產(chǎn)為主要研制對象，選擇Cho細胞以及上海某抗體藥物工程研究中心所提供的培養(yǎng)基原材料。進一步將干粉培養(yǎng)基以40、60、80和100℃作為四個溫度分界點，實際處理時間為10h。在使四個具備溫度點設(shè)定的干粉培養(yǎng)基與原方法處理的干粉培養(yǎng)基成為對照實驗，四個溫度點中的每個溫度點各增加兩個平行試驗，最大限度消除實驗誤差可能帶來的不良影響。在干粉培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)過程中，主要將細胞放置于初始原始細胞密度接近于1L的搖瓶，以十天為細胞培養(yǎng)時間。在整個培養(yǎng)過程中，確保搖瓶中的pH值不低于6.8，一旦pH值低于6.8，即進行補堿工作，確定培養(yǎng)基中每天的糖分為3g/l，培養(yǎng)溫度為37℃恒溫狀態(tài)，二氧化碳體積分數(shù)為5%左右，實際培養(yǎng)基搖瓶轉(zhuǎn)速為125轉(zhuǎn)/min。同時，試驗人員還應在細胞培養(yǎng)過程中每天取樣一定量細胞進行計數(shù)，在培養(yǎng)液1萬轉(zhuǎn)/s的離心狀態(tài)下離心5min，使離心后的液體可用于實驗理化數(shù)據(jù)參數(shù)分析。最后，選擇干粉培養(yǎng)基的分析方法，可采用細胞計數(shù)、葡萄糖乳酸測定方法甚至蛋白表達量測定方法等。

2.2 結(jié)果與討論

首先，探究不同溫度條件下所處理的培養(yǎng)基對培養(yǎng)基中活細胞密度的影響，在100℃的狀態(tài)下，干粉培養(yǎng)基中的活細胞密度最低，深入分析造成該現(xiàn)象的原因可知，可能是由于干粉培養(yǎng)基中某些物質(zhì)成分在100℃的高溫狀態(tài)處理下，會存在著部分物質(zhì)成分損失以及營養(yǎng)成分減少等問題，嚴重影響培養(yǎng)基中細胞的生長與繁殖，造成活細胞密度較低這一不良現(xiàn)象。在培養(yǎng)基的磨制過程中，實際磨制工藝在瞬時溫度高達80℃以上時，對培養(yǎng)基中的部分熱敏感物質(zhì)就會有較大破壞。

其次，探討不同溫度處理下的培養(yǎng)基對乳酸的最終影響，在100℃、80℃左右時，乳酸生產(chǎn)質(zhì)量濃度最高，高達1.75克/升以上。在60℃時，乳酸濃度處于集中狀態(tài)，40℃和對照組的實驗結(jié)果顯示乳酸濃度處于最低狀態(tài)。由于乳酸濃度較高，會直接抑制干粉培養(yǎng)基中細胞的實際生長速度和表達方式，由此可知，當乳酸濃度較高時，細胞密度則相對較低。究其原因可知，干粉培養(yǎng)基的實際處理溫度較高時，會對培養(yǎng)基成分造成一定影響，例如，會影響培養(yǎng)基中關(guān)于谷氨酰胺和轉(zhuǎn)鐵蛋白等物質(zhì)成分，而該類物質(zhì)成分與干粉培養(yǎng)基中細胞的生長和正常代謝息息相關(guān)，直接會影響干粉培養(yǎng)基中細胞的TCL循環(huán)。當能量代謝進入了糖酵解階段或是糖磷酸支路途徑時，乳酸濃度快速升高。而乳酸濃度越低，則說明干粉培養(yǎng)基中的實際能量代謝所釋放的ATP數(shù)量也就越多，越有利于干粉培養(yǎng)基中細胞的生長和正常代謝，乳酸濃度過高，則會影響干粉培養(yǎng)基的細胞能量代謝過程，抑制干粉培養(yǎng)基中細胞的生長和最終表達。

再者，探討不同溫度處理下的培養(yǎng)基對目的蛋白表達量和生產(chǎn)量的影響，其實驗結(jié)果可知，100℃溫度條件下處理的目的蛋白表達量最低，僅僅為2.06g/l，而40℃處理后的目的蛋白表達量和實際生長量與對照組蛋白量和實際生長量最高，分別達到了2.45和2.53g/l，其他溫度條件下所處理的目的蛋白表達量均低于40℃狀態(tài)下的目的蛋白表達量，而100℃時的目的蛋白表達量含量最低。由此進一步探究目的蛋白表達量和生長量受溫度的影響可知，由于干粉培養(yǎng)基中的部分成分在100℃的高溫條件處理下會存在著部分物質(zhì)損耗和營養(yǎng)成分的減少。

最后，綜合討論所有培養(yǎng)基實驗，對單因素結(jié)果和方差進行深度分析，比較不同培養(yǎng)基培養(yǎng)十天后的活細胞密度、乳酸含量以及其目的蛋白的表達量和生長量，并對其進行實驗結(jié)果和方差數(shù)據(jù)分析。由試驗可知，100℃的溫度條件下，活細胞的生長密度最低，而40℃的溫度條件下，活細胞的密度最高，其他溫度條件下處理的活細胞密度與對照組比較呈現(xiàn)出顯著性差異這一數(shù)理統(tǒng)計結(jié)果。當溫度條件為40℃時，pH值大于0.05，也就是數(shù)理統(tǒng)計上的非顯著性差異。就40℃和對照組的乳酸濃度問題而言，兩者處于最低狀態(tài)，濃度相差較小，呈現(xiàn)非顯著性差異，兩者數(shù)據(jù)信息較為接近。從目的蛋白的表達量和生長量來看，40℃和對照組為非顯著性差異，其他組與對照組則呈現(xiàn)出了顯著性差異，明顯高于其他不同條件溫度處理下的目的蛋白表達量和生長量。

2.3 結(jié)論

本文以不同溫度條件處理下的干粉培養(yǎng)基對Cho細胞培養(yǎng)以及目的蛋白表達量和生長量的影響為研究對象，確定了對干粉培養(yǎng)基表達和生產(chǎn)績效最高的實際處理溫度。進一步結(jié)合乳酸濃度、干粉培養(yǎng)基活細胞密度以及目的蛋白表達量數(shù)據(jù)，40℃和對照組遠遠優(yōu)于其他實驗組別，其中對照組的乳酸濃度最低，實際目的蛋白表達含量最高，但對照組的培養(yǎng)基在其干粉處理工序上較為繁復，實際生產(chǎn)效率較為低下，而40℃實驗組處理后的干粉培養(yǎng)基活細胞生長狀況與對照組為非顯著性差異，實際處理工序卻大幅度減少，處理難度進一步降低，生產(chǎn)效率快速提高。綜合考慮，40℃的干粉培養(yǎng)基處理工序為最佳處理溫度。

3 實際應用與價值

在培養(yǎng)基的實際生產(chǎn)過程中，加強對不同溫度條件下培養(yǎng)基原材料的干燥處理以及不同溫度條件下培養(yǎng)基中最終細胞生長量、目的蛋白表達量和生產(chǎn)量等的探討與研究，也就能不斷優(yōu)化無血清培養(yǎng)基的制備流程和工業(yè)生產(chǎn)流程，使無血清培養(yǎng)基能在生產(chǎn)成本快速降低和生產(chǎn)時間大量縮減的基礎(chǔ)上，不斷增強其最終生產(chǎn)質(zhì)量?？傊瑹o血清培養(yǎng)基的優(yōu)化處理能為國內(nèi)動物細胞培養(yǎng)進程提供一定支撐，也能為國內(nèi)其他抗體產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供一定思考。

4 前景展望

通過本文對無血清培養(yǎng)基關(guān)于不同溫度條件下的相關(guān)研究，能為無血清培養(yǎng)基在其他影響因素上的工藝流程設(shè)計與優(yōu)化提供一定參考，也能為其他類別干粉培養(yǎng)基工藝流程的縮減和優(yōu)化提供更多支撐，更能為國內(nèi)相關(guān)生物試驗的推進和國內(nèi)抗體產(chǎn)業(yè)的不斷擴大提供一定參考。

參考文獻：

[1]翁志兵，邵晨華，胡輝.無血清培養(yǎng)基干粉的生產(chǎn)工藝優(yōu)化[J].生物加工過程，2015，13（5）：57-59.