蒙燕瑤，杜洪志，王小波，呂 麗，吳昭會，李 瑋，陳志琳

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

苗藥八角楓為八角楓科植物八角楓Alangiumchinense(Lour．)Harms干燥根，味辛、苦，性微溫，有小毒，歸肝、心、腎經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、散瘀止痛之功[1]，常用于治療風(fēng)濕痹痛、四肢麻木、跌打損傷等?，F(xiàn)代藥理研究表明，八角楓醇提物、八角楓總堿均能有效地改善大鼠關(guān)節(jié)的紅腫和腫脹，并有效降低炎癥指數(shù)[2]。八角楓水提液可明顯降低CIA大鼠血清中的1L-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平[3]，而八角楓中的水楊苷及其衍生物八角楓苷A、龍膽酸-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、異它喬糖苷均具有較強(qiáng)的抗炎活性[4-5]。

但是八角楓毒性較大，且與劑量呈正相關(guān)，以至臨床使用中因服用過量而中毒死亡的情況時常發(fā)生，從而阻礙了這一民族藥的開發(fā)和利用。通過前期實地調(diào)研發(fā)現(xiàn)，我省黔南、黔東南部分苗族地區(qū)，常通過“半發(fā)酵”的方式炮制八角楓，而目前，有關(guān)該民族藥發(fā)酵炮制的相關(guān)研究未見報道?；诖?，本研究采用“固態(tài)發(fā)酵”法炮制苗藥八角楓，通過小鼠棉球肉芽腫抗炎試驗，研究發(fā)酵前后抗炎作用變化并篩選其抗炎有效部位，從而評價“固態(tài)發(fā)酵法”炮制八角楓的可行性，并初步確定抗炎有效部位，研究結(jié)果為進(jìn)一步探討苗藥八角楓發(fā)酵炮制作用機(jī)理及其減毒存效機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物

KM小鼠，SPF級，雌雄各半，體重18～22 g，均購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)20140010，SCXK(湘)20140011。

1.2 試藥

乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等均為分析純。羧甲基纖維素鈉(成都金山化學(xué)試劑有限公司，批號：20140302)；醋酸潑尼松(浙江仙琚制藥有限公司，批號：190231)；水合氯醛(雷根生物有限公司，批號：01/2020)；碘伏(德州安捷高科消毒制品有限公司，批號：20171002)；0.9%氯化鈉注射液(貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號：H2016004)，蒸餾水為實驗室自制。。

八角楓須根購自貴州省畢節(jié)市藥材市場，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院魏升華教授鑒定為八角楓(Alangiumchinense(Lour.)Harms)的根。

2 方法與結(jié)果

2.1 八角楓“固態(tài)發(fā)酵”炮制品的制備

根據(jù)相關(guān)研究報道[6-8]，結(jié)合優(yōu)選的發(fā)酵工藝制備八角楓發(fā)酵炮制品。取八角楓藥材干品，凈制、打粉，制備八角楓粗粉(20目)。取面粉、玉米粉、米糠按等比混合，作為發(fā)酵輔料備用。輔料組為藥物∶輔料=1∶3，無輔料組為藥物∶葡萄糖=1∶0.2，稱量藥材重量5%的酵母菌，加入10 mL蒸餾水活化1 h，兩組藥物分別混合均勻，加入適量蒸餾水，潤透，置于蒸鍋中蒸制1.5 h，放冷。兩組藥物各取一半作為輔料對照品組和無輔料對照品組，直接置于55 ℃烘箱中烘干備用。剩余部分分別加入活化的酵母菌液，攪拌均勻，蓋上蓋子，置于恒溫30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，取出置于55 ℃烘箱中烘干，得到輔料發(fā)酵品和無輔料發(fā)酵品，備用。

2.2 八角楓生品及發(fā)酵品醇提取物的制備

取八角楓生品及發(fā)酵炮制品各500 g，以8倍量80%的乙醇回流提取1 h，過濾，濾渣用6倍量80%的乙醇回流提取，每次1 h，提取2次，合并3次提取液，回收乙醇，所得稠膏置于水浴鍋上揮干，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 八角楓生品及發(fā)酵品不同極性部位的制備

根據(jù)2.2項下的方法制備八角楓生品和輔料發(fā)酵品的醇提物流浸膏，揮盡乙醇，加水制成混懸溶液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取(每種溶劑均250 mL×4)，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部分，剩下為水部分。55 ℃減壓回收溶劑后，根據(jù)生藥量，加入0.5%的CMC-Na水溶液進(jìn)行溶解，得到不同極性部位的提取液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 各給藥組溶液配制

八角楓的常規(guī)用量為3～9 g，取人的用量為9 g，體重60 kg，小鼠以20 g計，按照人與小鼠換算系數(shù)計算，得出小鼠給藥劑量為1.8 g/kg。

陽性藥醋酸潑尼松的給藥量以說明書用量為基礎(chǔ)，以人與小鼠換算系數(shù)計算，得出小鼠給藥劑量為0.7 mg/mL。各給藥組，均用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液(CMC-Na)配制成相應(yīng)濃度，分別置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 八角楓發(fā)酵前后抗炎試驗

取實驗小鼠70只，隨機(jī)分為7組，即(1)無輔料無發(fā)酵組、(2)無輔料發(fā)酵組、(3)生品組、(4)有輔料無發(fā)酵組、(5)有輔料發(fā)酵組、(6)陽性藥組、(7)模型對照組，每組10只。模型對照組給予等量0.5%CMC-Na溶液。均為灌胃給藥(0.1 mL/10 g)。實驗當(dāng)日給藥1 h后，腹腔注射4%水合氯醛溶液(0.1 mL/10g)，麻醉后，將小鼠腹部手術(shù)切口區(qū)的被毛剪除，用75%的乙醇擦拭消毒，剪開皮膚，用眼科鑷于小鼠左右腋下分別植入一個高壓滅菌棉球(10 mg±1 mg)，縫合傷口并涂抹碘伏消毒，常規(guī)飼養(yǎng)備用。次日，給各實驗小鼠傷口處涂抹碘伏，預(yù)防傷口感染，術(shù)后每天給藥1次，連續(xù)14天，于第14 d給藥1 h后脫頸處死，摘取棉球肉芽腫，于70 ℃烘箱中干燥4 h，稱重。抑制率(%)=[(模型對照組肉芽腫干重均值-給藥組肉芽腫干重均值)/模型對照組肉芽腫干重均值]×100%。

2.6 八角楓發(fā)酵前后抗炎有效部位篩選

取實驗小鼠108只，隨機(jī)分為12組，即生品總提物組、生品石油醚組、生品乙酸乙酯組、生品正丁醇組、生品水部位組、輔料發(fā)酵品總提物組、輔料發(fā)酵品石油醚組、輔料發(fā)酵品乙酸乙酯組、輔料發(fā)酵品正丁醇組、輔料發(fā)酵品水部位組、模型對照組、空白組，每組9只。其余操作同2.5項。

2.7 統(tǒng)計方法

2.8 八角楓發(fā)酵前后抗炎作用比較

無輔料發(fā)酵組、生品組、有輔料發(fā)酵組與模型對照組相比均能顯著減少肉芽組織的增生(P<0.01)，其中有輔料發(fā)酵組對肉芽腫的抑制率為33.33%，是除陽性對照外，抑制率最高的組別。關(guān)于各組小鼠的肉芽腫情況，結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠肉芽腫情況分析比較Tab.1 Comparison of granuloma in each group of mice

2.9 八角楓發(fā)酵前后各部位抗炎作用比較

2.9.1 各部位對棉球誘導(dǎo)的肉芽重量的影響

八角楓生品總提物、生品石油醚、生品乙酸乙酯、生品正丁醇、輔料發(fā)酵品總提物與模型對照組相比，均能減少肉芽腫增生(P<0.05)，其中對肉芽腫的抑制率最高的是生品乙酸乙酯組，抑制率達(dá)到30.56%(P<0.01)。各組小鼠的肉芽腫情況，結(jié)果見表2。

表2 八角楓炮制前后各部位抗炎試驗結(jié)果分析Tab.2 anti-inflammatory test results of Alangium chinensebefore and after processing

2.9.2 臟器重量、臟器系數(shù)分析

比較給藥后雌雄小鼠臟器重量及臟器系數(shù)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)分析藥物是否有性別趨勢。給藥后，脾、肺重量差異由不顯著(P>0.05)變?yōu)闃O顯著(P<0.01)。肝系數(shù)、腎臟系數(shù)差異由不顯著(P>0.05)變?yōu)闃O顯著(P<0.01)，脾系數(shù)由不顯著(P>0.05)變?yōu)轱@著(P<0.05)，體重差異由不顯著(P>0.05)變?yōu)闃O顯著(P<0.01)。結(jié)果見表3、表4。

表3 給藥組小鼠臟器重量、臟器系數(shù)測定結(jié)果(n=9)Tab.3 Measurement results of organ weight and organcoefficients of mice in the experimental group

續(xù)表3

表4 對照組小鼠臟器重量、臟器系數(shù)、肉芽重量測定結(jié)果(n=9)Tab.4 Measurement results of organ weight，organcoefficients and granuloma weight of mice in the control group

3 結(jié)果與討論

抗炎試驗結(jié)果表明，八角楓發(fā)酵品的抗炎作用顯著高于其生品，可見應(yīng)用“固態(tài)發(fā)酵”炮制八角楓能達(dá)到增效的目的，且有輔料發(fā)酵炮制效果比無輔料發(fā)酵好，提示輔料是影響炮制效果的主要因素之一，為其發(fā)酵炮制工藝的優(yōu)化提供重要依據(jù)。八角楓生品乙酸乙酯部位對棉球肉芽腫的抑制率最高(P<0.01)，發(fā)酵后，石油醚部位對棉球肉芽腫的抑制率最高(P>0.05)，即“固體發(fā)酵”后其有效部位發(fā)生了改變，但其發(fā)酵炮制作用機(jī)理，還需結(jié)合有效部位物質(zhì)變化進(jìn)一步研究。藥物對雌雄小鼠的體重、臟器及臟器系數(shù)的影響具有顯著性差異，提示藥物的毒性作用或具性別趨勢，但是雌雄小鼠肉芽重量無顯著性差異(P>0.05)，可見，藥物的抗炎效果不具有性別趨勢。

為考察體重的增加是否會直接導(dǎo)致小鼠腋下脂肪增厚，間接影響肉芽的重量，本次實驗，小鼠飼養(yǎng)過程均自由飲水飲食，使后期小鼠體重普遍增高。采用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件對體重和肉芽重量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示體重和肉芽重量的相關(guān)系數(shù)為0.063，且不顯著(P=0.459)，即體重和肉芽重量無顯著相關(guān)性，小鼠體重的增加不會影響抗炎試驗結(jié)果。

八角楓作為“消痹靈合劑”“風(fēng)濕定片”“楓荷梨祛風(fēng)濕酒”等制劑的主藥，臨床療效確切，但其毒性較大，且毒性物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制尚不明確，至今為止，除控制藥用劑量外，尚無有效措施保證其用藥安全。通過前期實地調(diào)研發(fā)現(xiàn)，我省黔南、黔東南部分苗族地區(qū)，常通過“半發(fā)酵”的方式炮制八角楓，但炮制效果及其作用機(jī)制均有待科學(xué)考證。

發(fā)酵作為傳統(tǒng)的炮制工藝，用其炮制毒性中藥，以達(dá)到減毒增效的例子比比皆是[9-11]，本研究以發(fā)酵炮制為切入點，應(yīng)用“固態(tài)發(fā)酵”法炮制八角楓，并采用小鼠棉球肉芽腫抗炎試驗評價其炮制效果，結(jié)果顯示“固態(tài)發(fā)酵”能夠提高八角楓的抗炎作用，而通過八角楓發(fā)酵前后各部位抗炎作用比較，初步確定乙酸乙酯為其抗炎有效部位，發(fā)酵后，有效部位發(fā)生改變，但仍具抗炎作用，其發(fā)酵炮制作用機(jī)理及抗炎機(jī)制有待進(jìn)一步研究。