唐秀松 方 剛 羅 俊 黃 安 陳秋霞 陳 靜

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯瑤藥工程技術(shù)研究中心， 南寧市 530200，電子郵箱：1145330495@qq.com)

2019年12月底新型冠狀病毒肺炎疫情的爆發(fā)，對(duì)我國(guó)人民生命健康造成嚴(yán)重危害，該病具有傳播速度快、傳染性強(qiáng)、人群普遍易感的特征，臨床多表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳、乏力，嚴(yán)重者可出現(xiàn)呼吸窘迫，多臟器功能衰竭甚至死亡[1-4]。中醫(yī)認(rèn)為，新型冠狀病毒肺炎屬于“溫疫”范疇，其病因病機(jī)為濕飲停聚，外加風(fēng)熱疫毒，肝木乘克脾土，脾虛運(yùn)化無(wú)權(quán)，濕邪內(nèi)生所致；病位在三焦或膜原，侵犯脾肺，可累及心、肝、腎、大腸；治療上主張以內(nèi)清熱、外涼解法治之[5-6]。中醫(yī)中藥在新型冠狀病毒肺炎的治療上發(fā)揮了極為關(guān)鍵的作用，包括臨床上常見的清肺排毒湯、連花清瘟顆粒、化濕敗毒湯、疏風(fēng)解毒膠囊等，并且治療效果明顯，且不少中藥方劑或中成藥被納入了新型冠狀病毒肺炎診療方案[7]。然而，很多中藥發(fā)揮治療作用的藥理機(jī)制卻尚未明確。

麻黃湯出自張仲景的《傷寒論》，是經(jīng)典名方之一，具有發(fā)汗解表、宣肺平喘之功效[8]。在此次疫情中，以麻黃湯為基礎(chǔ)方加減組成的方劑也發(fā)揮了很重要的作用，經(jīng)典的清肺排毒湯即包含了麻黃、桂枝、炙甘草、炒苦杏仁四味藥物，在張治國(guó)的“藥人”學(xué)說(shuō)中，麻黃湯也被推薦作為治療體格粗壯、皮膚較粗糙且干燥型的新型冠狀病毒肺炎患者的處方之一[9]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是構(gòu)建藥物與疾病之間“成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并能將其作用機(jī)制進(jìn)行可視化的一種高效方法，它是一種基于系統(tǒng)生物學(xué)來(lái)從整體的角度綜合分析藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響的一門學(xué)科[10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠有效預(yù)測(cè)藥物功能或特定功能所對(duì)應(yīng)的藥物，是目前中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的重要手段之一[11]。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)麻黃湯緩解新型冠狀病毒肺炎所致發(fā)熱的分子機(jī)制進(jìn)行研究，以期為麻黃湯的臨床進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)及用藥選擇。

1 資料與方法

1.1 麻黃湯有效活性成分與相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 分別以麻黃湯中各個(gè)藥物的名稱(麻黃、桂枝、苦杏仁、甘草)為關(guān)鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(http://ibts.hkbu.edu.hk/lsp/tcmsp.php)中進(jìn)行檢索，按照生物利用度≥30%、類藥性≥0.18進(jìn)行有效成分篩選[12]。在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)的“Related Targets”欄目中收集麻黃湯有效活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)(藥物靶點(diǎn))；再在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)中，利用Perl腳本對(duì)藥物靶點(diǎn)進(jìn)行基因注釋后獲取其對(duì)應(yīng)的人類基因，去除重復(fù)項(xiàng)后得到麻黃湯藥效成分調(diào)控的靶點(diǎn)。

1.2 疾病靶點(diǎn)基因收集 在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://omim.org/)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)中輸入關(guān)鍵詞“fever”，搜索與發(fā)熱相關(guān)的疾病靶點(diǎn)[13]，去除重復(fù)靶點(diǎn)后得到疾病相關(guān)靶點(diǎn)。運(yùn)用Venny平臺(tái)(版本2.1,http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將麻黃湯藥效成分調(diào)控的靶點(diǎn)與發(fā)熱的治療靶點(diǎn)取交集，得到麻黃湯治療發(fā)熱的靶點(diǎn)基因，即藥物-疾病交集的靶點(diǎn)基因(共194個(gè))。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因可視化 在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)中導(dǎo)入194個(gè)藥物-疾病交集的靶點(diǎn)基因，選擇檢測(cè)物種為人(Homo sapiens)，去除離散或無(wú)關(guān)聯(lián)的基因節(jié)點(diǎn)，取medium confidence值=0.04為篩選標(biāo)準(zhǔn)，最終得出相應(yīng)蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。按照基因Count值由大到小排序，選取前30個(gè)基因作為關(guān)鍵基因，運(yùn)用R×64 3.6.1軟件中的count.R程序包對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因進(jìn)行可視化，繪制樹狀圖。

1.4 靶點(diǎn)基因功能富集分析及通路富集分析 將所得194個(gè)交集基因?qū)隦×64 3.6.1軟件，進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)分類富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG) 通路分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 麻黃湯有效活性成分與相關(guān)靶點(diǎn) 麻黃湯中的有效活性成分共141個(gè)，主要包括槲皮素、豆甾醇、β-谷固醇、木犀草素、(+)-兒茶素、柚皮苷、沒食子酸、甘草糖苷E、香豆素A等；獲得潛在相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)9 770個(gè)，去除重復(fù)項(xiàng)后結(jié)果得到麻黃湯對(duì)應(yīng)的人類基因靶點(diǎn)222個(gè)。見表1。

表1 麻黃湯的活性成分、有效活性成分、潛在相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)(n)

2.2 麻黃湯治療發(fā)熱的靶點(diǎn)基因 去除重復(fù)靶點(diǎn)后得到疾病相關(guān)靶點(diǎn)7 073個(gè)。運(yùn)用Venny平臺(tái)取交集后得到麻黃湯治療發(fā)熱的靶點(diǎn)基因共194個(gè)，見圖1。

圖1 麻黃湯與新型冠狀病毒肺炎所致發(fā)熱的交集靶點(diǎn)

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵基因可視化結(jié)果 所構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中有194個(gè)節(jié)點(diǎn)，3 642條邊，平均每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度為37.5，平均局部聚類系數(shù)為0.593，PPI富集程度(P值)為<1016，見圖2。同時(shí)運(yùn)用R×64 3.6.1軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的30個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行可視化，繪制樹狀圖，見圖3。

圖2 麻黃湯治療新型冠狀病毒肺炎所致發(fā)熱的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)蛋白

2.4 交集靶點(diǎn)基因的GO富集分析及KEGG通路富集分析 GO分析共得到170個(gè)主要生物過程，主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、核受體活性等，見表2；KEGG通路富集分析結(jié)果顯示其主要涉及胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)信號(hào)通路、核因子κB(nuclear factor kappaB,NF-κB)信號(hào)通路、環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)-蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)信號(hào)通路等46個(gè)信號(hào)通路，見表3。

表2 GO功能富集分析結(jié)果(前20個(gè)生物過程)

表3 KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果(前20個(gè)通路)

3 討 論

麻黃湯為經(jīng)典方劑之一，其具有很強(qiáng)的代表性，其組方精練，功效顯著，是臨床治療外感病的基礎(chǔ)方劑[14]?？虑僭凇秱畞?lái)蘇集》中的“傷寒附翼”卷上對(duì)麻黃湯做出了較高的評(píng)價(jià)：“此湯入胃，行氣于玄府，輸精于皮毛，斯毛脈合精而溱溱汗出，在表之邪，其盡去而不留，痛止喘平，寒熱頓解，不煩啜粥而籍汗于谷也”[15]?，F(xiàn)代藥理研究表明，麻黃湯的有效組分不僅可抑制發(fā)熱大鼠致熱因子白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子α的釋放，還可降低體溫升高幅度，此外麻黃湯飲片湯劑同時(shí)還具有止咳、抗炎的效果[16-17]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析麻黃湯治療新型冠狀病毒肺炎所致發(fā)熱的作用機(jī)制，結(jié)果顯示，麻黃湯有效活性成分共141個(gè)，相關(guān)預(yù)測(cè)潛在靶點(diǎn)9 770個(gè)，與新型冠狀病毒肺炎所致發(fā)熱共有靶點(diǎn)194個(gè)，篩選出30個(gè)關(guān)鍵基因，GO基因富集分析得到主要生物過程170個(gè)，KEGG通路分析得到信號(hào)通路46條，這說(shuō)明麻黃湯具有通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路來(lái)緩解新型冠狀病毒肺炎所致發(fā)熱的作用。

本研究中，PPI網(wǎng)絡(luò)中的前30個(gè)關(guān)鍵核心靶點(diǎn)蛋白包括STAT3、AKT1、JUN、MAPK1、IL-6、CXCL2、VEGFA、IL-1B等，大多數(shù)是與誘導(dǎo)炎癥發(fā)生發(fā)展有關(guān)的蛋白。而新型冠狀病毒肺炎是一種由病毒感染而引起機(jī)體產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)的過程，并且炎癥的加重與細(xì)胞因子風(fēng)暴息息相關(guān)[18]。本研究結(jié)果還顯示，麻黃湯的主要有效活性成分包括槲皮素、豆甾醇、β-谷固醇、木犀草素、(+)-兒茶素、柚皮苷、沒食子酸、甘草糖苷E、香豆素A等。而槲皮素不僅具有抗氧化、抗炎作用，而且能作用于信號(hào)通路相關(guān)蛋白，如PI3K-Akt通路、酪氨酸激酶等，同時(shí)槲皮素可與新型冠狀病毒3CL水解酶結(jié)合而發(fā)揮抗病毒作用[19-20]。此外，豆甾醇[21]、木犀草素[22]、β-谷固醇[23]、(+)-兒茶素[24]、柚皮苷[25]、沒食子酸[26]等均具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用。

本研究GO生物過程功能富集結(jié)果顯示，麻黃湯緩解新型冠狀病毒肺炎所致發(fā)熱的生物過程主要集中于酶活性、受體激活、因子結(jié)合等方面，KEGG通路富集結(jié)果顯示其作用途徑主要有PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路等。其中，PI3K-Akt信號(hào)通路是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其對(duì)細(xì)胞功能具有重要影響，此通路的異常激活導(dǎo)致抗凋亡基因高表達(dá)，與炎癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[27]。HIF-1信號(hào)通路可能通過調(diào)節(jié)有關(guān)基因的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞凋亡等，進(jìn)而維持全身細(xì)胞、組織的氧穩(wěn)定并使它們耐受低氧狀態(tài)，以減少缺氧對(duì)全身細(xì)胞、組織帶來(lái)的損害[28]。在膿毒癥發(fā)病過程中，NF-κB信號(hào)通路具有重要介導(dǎo)作用，其正反饋調(diào)節(jié)可增強(qiáng)促炎因子基因的轉(zhuǎn)錄，其負(fù)反饋調(diào)節(jié)則能抑制促炎因子的表達(dá)，當(dāng)正負(fù)反饋調(diào)節(jié)失衡時(shí)就會(huì)引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),甚至是膿毒癥,最終導(dǎo)致多功能障礙綜合征[29]。cGMP-PKG信號(hào)通路則與組織缺血/再灌注損傷有關(guān)，研究表明，一氧化氮-環(huán)磷酸鳥苷酸-蛋白激酶G信號(hào)通路與低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫逃避密切相關(guān),可抑制或激活該信號(hào)通路而增強(qiáng)或抑制細(xì)胞的免疫逃避[30-31]。

綜上所述，麻黃湯緩解新型冠狀病毒肺炎所致發(fā)熱的機(jī)制是多靶點(diǎn)、多個(gè)生物過程、多途徑來(lái)共同參與的，其可能是通過抑制炎癥反應(yīng)、減弱病毒活性、保護(hù)組織等來(lái)緩解細(xì)胞因子風(fēng)暴，從而發(fā)揮緩解癥狀的作用。在實(shí)際臨床運(yùn)用中尚需謹(jǐn)守病機(jī)，隨證施治，為中醫(yī)藥更好地發(fā)揮抗擊疫情作用貢獻(xiàn)中醫(yī)的智慧和力量。