高麗麗，脫 穎，周建文，張芬芬，梁英杰，朱長樂

免疫組化技術(shù)已成為臨床病理診斷中常規(guī)檢測手段之一，特別是在判斷腫瘤組織的起源、分類以及良、惡性腫瘤的鑒別診斷等方面發(fā)揮重要作用。但在實(shí)際工作中，因工作環(huán)境、檢測方法及個(gè)人操作差異等因素影響染色結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。全自動(dòng)免疫組化儀的應(yīng)用對(duì)免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化染色起到了推動(dòng)作用，可以有效解決人為因素對(duì)染色結(jié)果的影響[1-4]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)四種全自動(dòng)免疫組化儀檢測五種抗體染色的結(jié)果進(jìn)行比較，優(yōu)化染色流程，最終達(dá)到一致性高的檢測結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料回顧性選取中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科存檔的浸潤性乳腺癌標(biāo)本5例和淋巴瘤標(biāo)本5例。

1.2 儀器設(shè)備與試劑全自動(dòng)免疫組化儀為美國Roche公司的Ultra、德國Leica公司的BOND-Ⅲ、丹麥DAKO公司的Link 48和Omnis。一抗分別為Ki-67(MIB-1)、CKpan(AE1/AE3)、CD5(4C7)、BCL-6(PG-Bbp)均購自丹麥DAKO公司，Calponin(EP63)購自北京中杉金橋公司。二抗及顯色系統(tǒng)、蘇木精復(fù)染液均為相應(yīng)儀器自帶套裝。

1.3 方法常規(guī)脫水、包埋石蠟組織塊，2～3 μm厚切片，并將切片撈于帶陽性對(duì)照的防脫片上，于60～70 ℃烤箱烘烤1～2 h。按提前設(shè)置好的程序上機(jī)染色，浸潤性乳腺癌標(biāo)本染色Ki-67、Calponin、CKpan；淋巴瘤標(biāo)本染色CD5、BCL-6，染色后的切片清洗后常規(guī)脫水、透明、封固。

2 結(jié)果

2.1 四款儀器染色比較Ki-67陽性定位于細(xì)胞核，為棕黃色著色。5例浸潤性乳腺癌標(biāo)本中，除1例出現(xiàn)四款儀器染色結(jié)果各不相同外，Link48染色陽性率和強(qiáng)度最低，Omnis和BOND Ⅲ染色強(qiáng)度較Link48強(qiáng)，但陽性率不高，Ultra染色陽性率和強(qiáng)度最高；其余染色結(jié)果一致(圖1)。Calponin陽性定位于細(xì)胞質(zhì)，為棕黃色著色。四款儀器免疫組化Roche Ultra染色強(qiáng)度較弱，其余染色結(jié)果一致。CKpan陽性定位于細(xì)胞質(zhì)，為棕黃色著色。四款儀器免疫組化Leica BOND-Ⅲ染色強(qiáng)度過強(qiáng)，其余染色結(jié)果一致。CD5陽性定位于細(xì)胞膜，為棕黃色著色。四款儀器免疫組化Leica BOND-Ⅲ染色強(qiáng)度過強(qiáng)，其余染色結(jié)果一致。BCL-6陽性定位于細(xì)胞核，為棕黃色著色。四款儀器免疫組化DAKO Link 48和Omnis染色強(qiáng)度較弱，其余染色結(jié)果一致。

圖1 四款儀器檢測Ki-67染色：A. DAKO Link 48染色；B. DAKO Omnis染色；C. Leica BOND-Ⅲ染色；D. Roche Ultra染色

2.2 優(yōu)化染色流程后四款儀器染色比較經(jīng)過測試，確定最終相應(yīng)抗體的染色流程調(diào)整。(1)Ki-67：DAKO Link48一抗孵育時(shí)間延長至30 min，DAB顯色時(shí)間延長至10 min；DAKO Omnis二抗孵育時(shí)間延長至25 min；Leica BOND Ⅲ延長抗原修復(fù)時(shí)間至30 min。(2)Calponin：Roche Ultra抗原修復(fù)時(shí)間延長至90 min。(3)CKpan：Leica BOND-Ⅲ抗原修復(fù)時(shí)間減短為10 min。(4)CD5：Leica BOND-Ⅲ染色程序未改動(dòng)，一抗1 ∶1稀釋。(5)BCL-6：DAKO Link 48二抗染色后增加增強(qiáng)試劑孵育30 min，阻斷劑調(diào)整至滴加一抗后孵育1 min；Omnis二抗染色后增加增強(qiáng)試劑孵育30 min。流程優(yōu)化后，各個(gè)抗體在四種檢測平臺(tái)上染色結(jié)果一致。

3 討論

Ki-67是重要的細(xì)胞增殖標(biāo)志物,腫瘤細(xì)胞增殖情況可作為預(yù)測惡性腫瘤發(fā)展及臨床預(yù)后的指標(biāo)，研究表明Ki-67表達(dá)與乳腺癌臨床病理特點(diǎn)及預(yù)后有一定的相關(guān)性；另外，近年來p16/Ki-67雙重染色檢測作為子宮頸癌篩查技術(shù)，改善了子宮頸癌篩查的靈敏度和特異性。

乳腺診斷病理中乳腺導(dǎo)管原位癌與早期微小浸潤癌的診斷與鑒別診斷一直是難點(diǎn)。是否存在肌上皮標(biāo)記是診斷有/無浸潤的關(guān)鍵。Calponin蛋白是一種相同分子質(zhì)量3.4×104多肽，在平滑肌組織中廣泛表達(dá)，并參與收縮機(jī)制。Calponin與肌纖維母細(xì)胞的交叉反應(yīng)較輕，特異性好，可作為臨床肌上皮標(biāo)志物。

細(xì)胞角蛋白是一種中間絲，在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)，并與相鄰細(xì)胞的細(xì)胞骨架相互作用。CK(AE1/AE3)又稱CKpan，屬于廣譜CK。CKpan已用于檢測常規(guī)病理檢查難以發(fā)現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移[5-6]。

CD5是T細(xì)胞和少數(shù)B細(xì)胞表面表達(dá)的一種相對(duì)分子質(zhì)量為6.7×104的糖蛋白。研究證實(shí)，CD5可以通過提供一些細(xì)胞因子控制異常的免疫反應(yīng)，但是CD5+淋巴細(xì)胞可能對(duì)人體有害。

BCL-6蛋白是生發(fā)中心B細(xì)胞的標(biāo)志物之一，也表達(dá)于生發(fā)中心細(xì)胞及其起源的淋巴瘤中?？膳cCD10一起作為濾泡中心B細(xì)胞的標(biāo)記。

免疫組化染色結(jié)果準(zhǔn)確性極大影響臨床病理診斷，特別在腫瘤鑒別診斷、早期微小浸潤等方面。為減少手工操作對(duì)免疫組化準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性的影響，大多數(shù)病理科已開展全自動(dòng)免疫組化染色。但是仍然會(huì)出現(xiàn)相同的抗體在不同檢測平臺(tái)上染色結(jié)果不一致，因此對(duì)于每一種科室新增、更換克隆號(hào)或批號(hào)的抗體都要進(jìn)行性能驗(yàn)證。若科室有不同廠家或型號(hào)免疫組化儀，性能驗(yàn)證既要縱向比較也要橫向比對(duì)，對(duì)于染色偏弱或強(qiáng)的抗體，橫向比對(duì)更容易發(fā)現(xiàn)問題。

免疫組化操作步驟復(fù)雜，影響其結(jié)果的因素很多，如抗體濃度、抗原修復(fù)時(shí)間、一抗/二抗/DAB孵育時(shí)間、H2O2抑制劑滴加順序、增強(qiáng)劑的使用等因素。目前大多病理技術(shù)員已使用儀器進(jìn)行免疫組化染色，儀器染色的流程、每一種試劑的用途，染色程序的設(shè)置，都應(yīng)該熟悉掌握。當(dāng)出現(xiàn)染色異常時(shí)，我們能及時(shí)調(diào)整染色流程，優(yōu)化方案，最終呈現(xiàn)出準(zhǔn)確穩(wěn)定的染色結(jié)果。