徐慧慧，劉 紅，李 艷，潘靜華，王少君，曹金鳳，趙宏艷

破骨細胞屬于組織特異性的多核巨噬細胞，來源于骨髓造血單核巨噬細胞系，在類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)及其繼發(fā)的骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用?？咕剖崴嵝粤姿崦?tartrate-resistant acid phosphatase, TRACP)是破骨細胞分化成熟的標志物，也與破骨細胞骨吸收功能密切相關[1-2]。應用TRACP染色檢測破骨細胞分化及觀察破骨細胞活性是實驗室常用技術之一，TRACP染色方法較多，多采用酸性磷酸酶試劑盒檢測。本課題組前期進行體外培養(yǎng)的破骨細胞采用該試劑盒染色，破骨細胞質(zhì)呈紫紅色，染色清晰，染色效果理想[3]。但組織切片采用該方法則背景偏黃，對比度不高，體積較小的破骨細胞及其前體難以辨認。本實驗以RA的經(jīng)典模型——膠原誘導性關節(jié)炎(collagen induced arthritis, CIA)大鼠關節(jié)石蠟切片為觀察對象，采用三種TRACP染色方法分析破骨細胞的表達，以期尋找一種染色效果好、穩(wěn)定性強且性價比高的染色方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1材料 正常大鼠和CIA大鼠關節(jié)石蠟切片。

1.1.2試劑 萘酚AS-MX磷酸鹽、N，N-二甲基甲酰胺、快紅TR鹽、氯化亞錳、酒石酸鈉、固紅紫色LB鹽、酸性磷酸酶試劑盒，均購自Sigma Aldrich公司。

1.2 方法(1)以快紅TR鹽為顯色劑的TRACP染色方法[4]：染液配制0.1 mol/L Tris孵育液(pH 5.0)含有1.35 mmol/L萘酚AS-MX磷酸鹽，0.362 mol/L N，N-二甲基甲酰胺、3.88 mmol/L快紅TR鹽、0.5 mmol/L氯化亞錳和25 mmol/L酒石酸鈉。切片經(jīng)常規(guī)方法脫蠟入水，浸入上述孵育液中，37 ℃避光孵育40 min。蒸餾水洗滌3 min×3次。蘇木精復染，蒸餾水沖洗3 min×3次，水溶性封片劑封片。光鏡下觀察，并拍照分析。(2)以固紅紫色LB鹽為顯色劑的TRACP染色方法[5]:孵育液配制0.1 mol/L Tris緩沖液(pH 5.0)含有1.35 mmol/L萘酚AS-MX磷酸鹽，0.362 mol/L N，N-二甲基甲酰胺、3.88 mmol/L固紅紫色LB鹽和25 mmol/L酒石酸鈉。切片經(jīng)常規(guī)方法脫蠟入水，浸入上述孵育液中，37 ℃避光孵育15 min。蒸餾水洗滌3 min×3次。蘇木精復染，蒸餾水沖洗3 min×3次，水溶性封片劑封固。光鏡下觀察，并拍照分析。(3)酸性磷酸酶試劑盒的TRACP染色方法[6]：染液的配制取0.5 mL固深紅GBC與0.5 mL亞硝酸鈉溶液混勻，靜置2 min，然后加入預熱去離子水45 mL、0.5 mL萘酚AS-BI、2 mL醋酸溶液、1 mL酒石酸鹽溶液。切片經(jīng)常規(guī)方法脫蠟入水，浸入上述孵育液中，37 ℃避光孵育45 min。蒸餾水洗滌3 min×3次。蘇木精復染，蒸餾水沖洗3 min×3次，水溶性封片劑封固。光鏡下觀察，并拍照分析。

2 結(jié)果

2.1 正常大鼠和CIA大鼠關節(jié)切片中破骨細胞的表達大鼠關節(jié)組織切片經(jīng)TRACP染色后，破骨細胞及破骨細胞前體胞質(zhì)酶活性部位可見有不溶性紫紅色顆粒樣沉淀。典型的破骨細胞體積較大，含有多核，形態(tài)不規(guī)則。

正常大鼠滑膜組織和骨髓組織中TRACP染色陽性的破骨細胞少見；而在CIA大鼠增生的滑膜組織中可見有大小不一、深淺不同的TRACP染色陽性的破骨細胞。此外，在CIA大鼠膝關節(jié)脛骨和股骨的骨骺及骨干的髓腔內(nèi)，也可見TRACP染色陽性的破骨細胞，多位于骨小梁邊緣。若關節(jié)軟骨被滑膜侵蝕，則骨骺端內(nèi)TRACP染色陽性的破骨細胞明顯增多(圖1)。

圖1 正常大鼠與CIA大鼠關節(jié)破骨細胞的表達，TRACP染色：A.正常大鼠膝關節(jié)滑膜組織，藍色箭頭示軟骨組織；B.CIA大鼠膝關節(jié)滑膜組織，綠色箭頭示破骨細胞，黃色箭頭示骨組織；C.正常大鼠膝關節(jié)骨髓組織，黃色箭頭示骨組織；D.CIA大鼠膝關節(jié)骨髓組織，綠色箭頭示破骨細胞，黃色箭頭示骨組織

2.2 三種TRACP染色法對CIA大鼠滑膜組織中破骨細胞表達的影響采用三種TRACP法染色，CIA大鼠關節(jié)切片滑膜組織均可見TRACP染色陽性的破骨細胞，但表達強度和染色效果明顯不同，其中檢測效果較為理想的是以快紅TR鹽為顯色劑和以固紅紫色LB鹽為顯色劑的TRACP染色方法。與酸性磷酸酶試劑盒的TRACP染色方法相比，前兩種方法染色的切片背景著色淺，且可以檢測較小的破骨細胞及破骨細胞前體(圖2)。

圖2 CIA大鼠滑膜組織中破骨細胞的表達：A.以快紅TR鹽為顯色劑的TRACP染色法，綠色箭頭示破骨細胞；B.以固紅紫色LB鹽為顯色劑的TRACP染色法，綠色箭頭示破骨細胞；C.酸性磷酸酶試劑盒的TRACP染色法，綠色箭頭示破骨細胞 圖3 CIA大鼠骨髓組織中破骨細胞的表達：A.以快紅TR鹽為顯色劑的TRACP染色法，綠色箭頭示破骨細胞；B.以固紅紫色LB鹽為顯色劑的TRACP染色法，綠色箭頭示破骨細胞；C.酸性磷酸酶試劑盒的TRACP染色法，綠色箭頭示破骨細胞

2.3 三種TRACP染色法對CIA大鼠骨髓組織中破骨細胞表達的影響經(jīng)三種方法染色后，CIA大鼠關節(jié)切片骨髓組織均可見TRACP染色陽性的破骨細胞，但表達程度和染色效果明顯不同。與滑膜組織切片染色結(jié)果相似，以快紅TR鹽為顯色劑和以固紅紫色LB鹽為顯色劑的TRACP染色方法的檢測效果更為理想；與酸性磷酸酶試劑盒的TRACP染色方法相比，前兩種染色的切片背景著色淡，且可以檢測到較小的破骨細胞及破骨細胞前體。快紅TR鹽為顯色劑的TRACP法染色的靈敏度優(yōu)于固紅紫色LB鹽為顯色劑的染色法(圖3)。

3 討論

RA的主要特征是關節(jié)滑膜炎癥和軟骨、骨的進行性破壞，骨質(zhì)破壞及由此產(chǎn)生的功能障礙是RA致殘的主要原因。多種細胞參與該過程[7]，而破骨細胞的過度活化、增殖在RA骨破壞進程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)RA病灶部位有大量成熟的破骨細胞及破骨細胞前體[8-9]，其過度增殖和異常活躍打破骨代謝平衡，使骨吸收占優(yōu)勢，從而完成了由滑膜炎癥到骨質(zhì)破壞的病理轉(zhuǎn)變。因此，鑒定破骨細胞的分化及骨吸收功能在RA及其他代謝性骨病的研究中具有重要意義。

當破骨細胞分化成熟時，胞質(zhì)中可產(chǎn)生大量的TRACP，因此在病理診斷中可以用TRACP染色法檢測破骨細胞。TRACP染色原理：染色孵育液是以萘酚磷酸鹽作為底物，以快紅TR鹽、固紅紫色LB鹽、六偶氮副品紅等作為顯色劑。當酒石酸鈉存在酸性條件下，萘酚磷酸鹽經(jīng)酸性磷酸酶水解可以釋放磷酸和萘酚，萘酚與顯色劑偶聯(lián)從而形成不溶性染料，紅色染料沉積在胞質(zhì)中含有TRACP的酶活性部位。

酸性磷酸酶試劑盒是實驗中常用的快速檢測破骨細胞的方法，我們在實驗中發(fā)現(xiàn)對于體外誘導培養(yǎng)的破骨細胞采用該試劑盒染色，破骨細胞質(zhì)呈紫紅色，染色清晰，染色效果理想。但組織切片采用該試劑盒染色后，切片背景色偏黃，對比度差，破骨細胞輪廓不清晰，或體積較小的破骨細胞難以辨認。為提高染色效果，本實驗以CIA大鼠關節(jié)石蠟切片為分析對象，觀察三種TRACP法在破骨細胞中的表達差異。結(jié)果顯示：三種染色方法組織切片中均可見TRACP染色陽性的破骨細胞，其中檢測效果最為理想的是快紅TR鹽為顯色劑的TRACP染色法，該方法染色背景色淡染，破骨細胞清晰，可見體積較小的破骨細胞。試劑盒染色后，切片背景色偏黃，對比度差。以固紅紫色LB鹽為顯色劑的TRACP染色法也取得了較好的染色效果，但綜合考慮實驗經(jīng)費(顯色劑固紅紫色LB鹽價格明顯高于快紅TR鹽)等原因，我們推薦以快紅TR鹽為顯色劑的TRACP染色法用于組織切片中破骨細胞的檢測。對于體外培養(yǎng)的破骨細胞三種染色方法均可，可根據(jù)實驗自行選擇。

TRACP染色時應注意染色孵育液需現(xiàn)用、現(xiàn)配，孵育液的pH值可以影響酶的活性，對染色效果影響較大，本實驗采用pH 5.0的染色液取得了較好的效果。有文獻報道[10]染液pH值為5.0～5.2時，染色背景常有顆粒沉渣，經(jīng)蒸餾水水洗易脫片；本實驗無此現(xiàn)象，可能與實驗試劑及切片的黏附方式不同有關。此外，染色液孵育時間也需要根據(jù)樣品進行調(diào)整，如小鼠樣品切片可適當延長染色時間。