王 曼，韓 莎，李 勝，張國(guó)安，王業(yè)全，崔 文

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是最常見(jiàn)的甲狀腺惡性腫瘤，占甲狀腺癌的80%～85%[1]。BRAF及TERT突變是PTC發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一[2]，但PTC的發(fā)病機(jī)制并不十分明確。最新研究結(jié)果表明，自噬對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著直接的關(guān)系[3]。在自噬小體的形成過(guò)程中，ATG5作為泛素樣連接系統(tǒng)ATG12-ATG5-ATG16的關(guān)鍵因子，通過(guò)對(duì)自噬活性的調(diào)節(jié)，在惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展中具有促進(jìn)或抑制作用[4-5]。目前，關(guān)于ATG5在PTC中的表達(dá)情況尚不明確。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATG5在正常甲狀腺組織、PTC原發(fā)灶、癌旁組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)，分析其與PTC臨床病理特征的關(guān)系，探討ATG5表達(dá)的改變?cè)赑TC發(fā)生、發(fā)展中的意義，為PTC的治療尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2017年山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院病理科確診的100例PTC，均具有完整的臨床及隨訪資料，包括患者年齡、性別、術(shù)前體重、身高、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)、月經(jīng)狀況、腫瘤大小、包膜浸潤(rùn)與否、多灶性、甲狀腺侵襲性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、是否伴有橋本甲狀腺炎和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫。100例患者中男性27例，女性73例；年齡最小者17歲，最大者75歲，平均46.33歲。本組分別選取100例PTC原發(fā)灶、癌旁組織及其50例PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行分析，另選取23例正常甲狀腺組織作為對(duì)照。所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 免疫組化兔抗人ATG5(ab108327，1 ∶100)多克隆抗體購(gòu)自中國(guó)Abcam公司，DAB染色液套盒購(gòu)自羅氏公司。標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定后取材，經(jīng)LEICA APS300S全自動(dòng)脫水機(jī)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，利用羅氏公司的全自動(dòng)免疫組化染色儀Benchmark XT及其配套二抗試劑盒、DAB染色液套盒，采用液蓋膜渦流混勻法進(jìn)行免疫組化染色，鏡下觀察。

1.3 結(jié)果判定結(jié)果判讀參考文獻(xiàn)[6]。由兩名具有中級(jí)以上職稱(chēng)的病理醫(yī)師分別采用雙盲法進(jìn)行閱片，綜合評(píng)出最后結(jié)果。其中，每張切片隨機(jī)取5個(gè)400倍視野，每個(gè)視野均進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分和著色強(qiáng)度評(píng)分。按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～100%為3分。ATG5表達(dá)定位于細(xì)胞膜，陽(yáng)性結(jié)果呈棕黃色或棕褐色，按細(xì)胞著色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)明顯著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：(評(píng)分范圍0～9分)?？偡?6分為低表達(dá)(陰性)，總分≥6分則為高表達(dá)(陽(yáng)性)。

2 結(jié)果

2.1 PTC原發(fā)灶、癌旁組織、正常甲狀腺組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中ATG5的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，ATG5大部分定位于細(xì)胞膜，小部分定位于細(xì)胞質(zhì)。PTC原發(fā)灶、癌旁組織、正常甲狀腺組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中ATG5的表達(dá)各不相同，著色強(qiáng)度有差異(圖1)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，ATG5在正常甲狀腺組織的陽(yáng)性率為17.4%(4/23)，在癌旁組織中的陽(yáng)性率為31.0%(31/100)，在PTC組織中的陽(yáng)性率為82.0%(82/100)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的陽(yáng)性率為96.0%(48/50)。正常甲狀腺組織和癌旁組織相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；正常甲狀腺組織與PTC組織(P<0.01)，癌旁組織與PTC組織(P<0.01)，PTC組織與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織(P<0.05)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖1 ATG5在甲狀腺組織中的表達(dá)：A.正常甲狀腺組織；B.PTC癌旁組織；C.PTC原發(fā)灶；D.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶；下圖為上圖的局部放大

圖2 不同甲狀腺組中ATG5的表達(dá)

2.2 PTC組織中ATG5的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系PTC組織中ATG5蛋白表達(dá)與患者性別、體重、BMI、多灶性、雙葉多發(fā)、浸潤(rùn)包膜、伴有結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)(P>0.05)，與患者年齡、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)侵犯數(shù)目有關(guān)(P<0.05)，年齡≤40歲、腫瘤直徑>1 cm、淋巴結(jié)侵犯?jìng)€(gè)數(shù)>3個(gè)的PTC患者ATG5的表達(dá)水平較高(表1)。

表1 PTC組織中ATG5蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

3 討論

自噬性程序性細(xì)胞死亡，簡(jiǎn)稱(chēng)自噬，是一種新的程序性細(xì)胞死亡方式，在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化以及腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，又稱(chēng)為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡。在癌癥發(fā)生早期，自噬可以通過(guò)溶酶體的消化降解作用，去除細(xì)胞內(nèi)異常的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起抑制作用。在癌癥進(jìn)展期，自噬可以降解細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞提供生存所需能量，特別是在低氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏時(shí)，自噬則對(duì)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖起促進(jìn)作用。自噬小體的形成是自噬過(guò)程的關(guān)鍵，而自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene, ATG)則在自噬小體的形成中起主要的調(diào)控作用，并參與自噬體形成的兩個(gè)泛素樣蛋白系統(tǒng)即ATG12-ATG5-ATG16和ATG8-LC3共軛系統(tǒng)。其中，ATG12-ATG5-ATG16復(fù)合物在自噬小體生成時(shí)參與膜小葉的形成和膜的延伸。有研究表明，在ATG12-ATG5-ATG16復(fù)合物中，ATG5起關(guān)鍵作用，并直接與許多蛋白質(zhì)相互作用，在自噬體成熟中至關(guān)重要，是自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

ATG5在腫瘤組織中的表達(dá)與腫瘤類(lèi)型有關(guān)。李佽等[5-8]研究均發(fā)現(xiàn)ATG5在前列腺癌中表達(dá)顯著高于良性前列腺增生或正常細(xì)胞。在肝癌[9]及非小細(xì)胞肺癌[10]中ATG5表達(dá)均高于癌旁組織。Cao等[11]的研究顯示ATG5在胃癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常組織，但An等[12]研究卻顯示其表達(dá)低于正常組織。在結(jié)腸癌中，ATG5的表達(dá)也降低[13]。在腎透明細(xì)胞癌中，ATG5表達(dá)高于癌旁組織，其高表達(dá)與腫瘤惡性程度[14]、患者低生存率相關(guān)。在乳腺癌中，約40%病例ATG5陽(yáng)性，且ATG5陽(yáng)性患者無(wú)瘤生存期更長(zhǎng)。在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，ATG5高表達(dá)的患者其生存率高于低表達(dá)患者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.064)。在上皮性卵巢癌組織中ATG5的表達(dá)明顯低于良性卵巢組織及正常卵巢組織。ATG5在不同惡性腫瘤中表達(dá)趨勢(shì)及臨床病理意義并不相同，可能由于自噬是一個(gè)涉及多種ATG的復(fù)雜過(guò)程，并且自噬在腫瘤的不同階段可能起不同的作用。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)PTC、癌旁組織、正常甲狀腺組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中ATG5蛋白的表達(dá)，證實(shí)PTC組織中ATG5的表達(dá)顯著高于癌旁組織及正常甲狀腺組織，明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。其次通過(guò)ATG5的表達(dá)與臨床病理特征分析可知，PTC組織中ATG5蛋白表達(dá)與患者年齡、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)侵犯數(shù)目有關(guān)(P<0.05)，且年齡≤40歲、腫瘤直徑>1 cm、淋巴結(jié)侵犯?jìng)€(gè)數(shù)>3個(gè)的PTC患者ATG5的表達(dá)水平高，提示ATG5可能參與PTC的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。

綜上所述，ATG5在PTC中的表達(dá)高于正常甲狀腺組織，低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，提示其可能參與了PTC的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移過(guò)程。其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。