陳 玉，周 強(qiáng)

消化系統(tǒng)腫瘤是人類常見的疾病之一，隨著工業(yè)化進(jìn)程和人們生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的改變，其整體發(fā)病率呈年輕化且有上升趨勢，但其病變特點(diǎn)、發(fā)生和發(fā)展機(jī)制尚不清楚[1]。食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，病死率高，可分為鱗狀細(xì)胞癌及腺癌兩種病理類型，我國約90%食管癌患者為食管鱗狀細(xì)胞癌，其發(fā)生是一個多因素、多步驟的生物學(xué)過程。目前，食管癌的主要病因有遺傳易感因素、化學(xué)類亞硝胺物質(zhì)、缺乏某些微量元素、煙酒、熱食、熱飲、口腔不潔以及生物性病因，如真菌感染，其中真菌是主要因素。目前，真菌在食管上皮性病變中的檢出率報道較少，六胺銀染色主要對組織中的真菌著色。本文采用HE和六銨銀染色檢測食管病變組織中真菌的陽性率，探討真菌檢測在食管上皮性病變中的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年9月～2019年3月南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院病理科食管鱗狀上皮性病變125例，其中低度上皮內(nèi)瘤變30例、高度上皮內(nèi)瘤變30例、鱗狀細(xì)胞癌35例、慢性食管炎伴鱗狀上皮增生30例?；颊吣行?4例，女性51例，年齡40～74歲，平均(58.3±4.8)歲。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 方法(1)HE染色：每個病例選取1張白片進(jìn)行HE染色，使用DAKO全自動染色機(jī)染色；顯微鏡高倍視野觀察有無真菌。(2)六銨銀染色：每個病例選取1張黏附載玻片撈片的白片，60 ℃烘箱，烤片30 min，二甲苯脫蠟3次，無水乙醇脫二甲苯3次，流水沖洗數(shù)秒，置入鉻酸氧化10 min，胺銀染液70 ℃浸染60 min，鏡下觀察染色程度至標(biāo)本轉(zhuǎn)變成黃褐色，流水沖洗數(shù)秒，0.1%氯化金調(diào)色1～2 min，流水沖洗數(shù)秒，伊紅復(fù)染10 s，流水沖洗，DAKO全自動染色機(jī)選擇封片程序封固。鏡下1 000倍視野觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同染色方法在食管上皮性病變的真菌檢出率HE染色在慢性食管炎伴鱗狀上皮增生和低度上皮內(nèi)瘤變真菌檢出率均為0(圖1)，在高度上皮內(nèi)瘤變和鱗狀細(xì)胞癌中的檢出率較高分別為6.7%和14.3%(圖2、3)。六銨銀染色法在慢性食管炎伴鱗狀上皮增生中為0，在低度上皮內(nèi)瘤變中為30%(圖4)，高度上皮內(nèi)瘤變的檢出率為33.3%(圖5)，鱗狀細(xì)胞癌中檢出率60%(圖6)。在高度上皮內(nèi)瘤變及鱗狀細(xì)胞癌中，HE及六銨銀染色在診斷真菌檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.67，P<0.05；χ2=17.35，P<0.05，表1)。

圖1 食管低度上皮內(nèi)瘤變未見真菌附著，HE染色 圖2 食管高度上皮內(nèi)瘤變見真菌附著，HE染色 圖3 食管鱗狀細(xì)胞癌見真菌附著，HE染色 圖4 食管低度上皮內(nèi)瘤變表面未見真菌附著，表面脫落的正常上皮碎片可能在六銨銀染色下誤診為真菌，六銨銀染色 圖5 食管高度上皮內(nèi)瘤變表面見真菌附著，六銨銀染色 圖6 食管鱗狀細(xì)胞癌表面見真菌附著，六銨銀染色

表1 不同染色在食管上皮性病變中的真菌檢出率

2.2 HE聯(lián)合六銨銀染色在食管上皮性病變中的真菌檢出率HE聯(lián)合六銨銀染色在不同食管上皮性病變中真菌檢出率不同，在慢性食管炎伴鱗狀上皮增生和低度上皮內(nèi)瘤變中的檢出率為0和16.7%，在高度上皮內(nèi)瘤變和鱗狀細(xì)胞癌中的檢出率為36.7%和57.1%，隨著食管上皮性病變惡性程度增生，真菌檢出率有提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=35.95，P<0.05，表1)。

3 討論

目前，上消化道腫瘤與微生物菌群的分析還處于起步階段，多項流行病學(xué)研究均提示上消化道腫瘤與微生物菌群密切相關(guān)[2-4]。癌前病變的特征性菌群可為腫瘤的早診斷、早治療提供新的理論依據(jù)，具有潛在的應(yīng)用前景。識別上消化道癌的標(biāo)志性菌群不僅可以通過改變菌群組成來治療疾病，也可用于腫瘤預(yù)后復(fù)發(fā)評估及預(yù)警，進(jìn)一步探討微生物菌群在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制，是上消化道腫瘤預(yù)防領(lǐng)域的研究方向[5]。

組織中真菌檢測采用HE染色一般著色不佳，只有當(dāng)真菌數(shù)量較多時HE染色法才可鑒別。六銨銀染色可用于組織切片中真菌的檢測，與HE和PAS染色相比，其更適合真菌感染檢測，特別是在僅有少量有機(jī)體的情況下。本實(shí)驗(yàn)在鱗狀細(xì)胞癌中單純采用HE染色辨別真菌陽性率僅有14.3%，聯(lián)合六銨銀進(jìn)行判斷陽性率提升至57.1%，表明六銨銀染色在真菌的診斷及鑒別診斷具有重要意義。

本組中不同級別的食管上皮性病變中，真菌的檢出率隨著疾病組織學(xué)類型的改變而逐漸升高，提示真菌在不同階段食管上皮性病變的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。我國對食管癌高發(fā)區(qū)研究表明，癌前病變或早期食管癌患者的食管上皮中存在真菌感染，其中念珠菌屬真菌是最常見的真菌類型[6]。Hsia等[7]報道白色念珠菌能夠增強(qiáng)食道特異性致癌物芐基甲基亞硝胺-亞硝酸鹽形成，從而誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。以上證據(jù)表明，真菌在食管癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用，并成為腫瘤微環(huán)境研究熱點(diǎn)。食管癌中真菌檢出率增強(qiáng)可能與腫瘤局部免疫微環(huán)境受到破壞、菌群失調(diào)引起真菌定植相關(guān)，但有關(guān)真菌在食管腫瘤發(fā)生及影響腫瘤微環(huán)境中的菌體作用研究尚缺乏，需要進(jìn)一步分析。

特殊染色是病理診斷的輔助技術(shù)，雖然沒有免疫組化的敏感性和特異性高，但對某些疾病的病理診斷發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)階段特殊染色試劑盒和全自動儀器還未普及，特殊染色操作多由手工完成，試劑也多需自配，導(dǎo)致結(jié)果穩(wěn)定性較差。因此在特殊染色操作中，應(yīng)采用外部陽性對照，尤其是六銨銀和抗酸染色，以防漏診。另外，六銨銀染色雖然在日常診斷中敏感性高，但特異性低，在真菌檢出方面可能與正常雜菌或脫落的上皮碎片混淆，仍需聯(lián)合HE進(jìn)一步診斷。在病理技術(shù)方面，HE及免疫組化染色均通過全自動化設(shè)備(如全自動HE染色機(jī)及全自動免疫組化染色機(jī))實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作，成為病理質(zhì)量控制的可靠工具，為病理實(shí)驗(yàn)室的國際標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展接軌也起重要作用，因此特殊染色的全自動操作是病理技術(shù)發(fā)展的必然趨勢。如果能采用全自動特殊染色技術(shù)，可為檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)一步提供保證，使病理技術(shù)操作具有規(guī)范化和穩(wěn)定性[8]。

綜上所述，采用不同染色方法在食管上皮性病變中真菌檢出陽性率不同，其與食管上皮性病變級別增加相關(guān)，六銨銀聯(lián)合HE染色對食管真菌的檢出準(zhǔn)確率的提高具有重要意義。