杜春平，曾麗霞，陳志寧，陳肖瑜，林思彤，駱成飄，馬 韻

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，包含多種病理組織學(xué)類型，其中甲狀癌乳頭狀癌是最常見的類型[1-2]。甲狀腺癌分子機(jī)制的分析，能夠推動(dòng)其診療技術(shù)的發(fā)展[3-4]。酪氨酸硫酸化轉(zhuǎn)移酶1(tyrosylprotein sulfotransferase 1, TPST1)主要負(fù)責(zé)催化細(xì)胞內(nèi)酪氨酸硫酸化。研究發(fā)現(xiàn)TPST1在部分癌組織中表達(dá)下調(diào)，并與臨床病理特征相關(guān)[5]。TPST1與甲狀腺癌關(guān)系尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過多個(gè)甲狀腺乳頭狀癌研究隊(duì)列的大數(shù)據(jù)和免疫組化檢測，分析TPST1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)、臨床及其分子意義，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源甲狀腺乳頭狀癌隊(duì)列分別來自癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, https://portal.gdc.cancer.gov)的THCA隊(duì)列；基因芯片公共數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)的GSE27155、GSE3467和GSE6004隊(duì)列。THCA隊(duì)列的RNA測序數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)包含572例樣本(腫瘤組513例、對照組59例)。GSE27155、GSE3467和GSE6004隊(duì)列的基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)分別包含55例(腫瘤組51例、對照組4例)、18例(腫瘤組9例、對照組9例)和18例(腫瘤組14例、對照組4例)樣本。

1.2 數(shù)據(jù)分析UCSC Xena軟件(https://xenabrowser.net)分析TPST1 mRNA在THCA隊(duì)列中的表達(dá)。GEO2R軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)分析TPST1 mRNA在GSE27155、GSE3467和GSE6004隊(duì)列中的表達(dá)。R軟件(https://www.r-project.org)分析THCA隊(duì)列的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選與TPST1相關(guān)的差異表達(dá)基因。R軟件對差異基因進(jìn)行基因本體論(Gene ontology, GO)富集分析。

1.3 免疫組化收集2020年1～4月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院16例甲狀腺乳頭狀癌和癌旁正常組織。TPST1多克隆抗體購自O(shè)rigene公司。免疫組化采用EnVision法染色，具體操作步驟及評分方法詳見文獻(xiàn)[6]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，患者均簽署知情同意書。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用R軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。秩和檢驗(yàn)分析TPST1 mRNA的差異表達(dá)，并用中位數(shù)表示。TPST1蛋白的差異表達(dá)采用t檢驗(yàn)，并用平均數(shù)表示。以TPST1 mRNA中位數(shù)為參照，低于中位數(shù)為低表達(dá)組，高于中位數(shù)為高表達(dá)組。兩者的相關(guān)性采用χ2和r檢驗(yàn)。Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)比較TPST1低、高表達(dá)組間的預(yù)后。Pearson相關(guān)檢驗(yàn)篩選TPST1的差異表達(dá)基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：P<0.05，r>0.4或<-0.4。

2 結(jié)果

2.1 各甲狀腺組織中TPST1 mRNA的表達(dá)應(yīng)用4個(gè)甲狀腺乳頭狀癌隊(duì)列分析587例甲狀腺乳頭狀癌組織和76例對照組織，分析TPST1 mRNA的差異表達(dá)。與對照組相比(THCA隊(duì)列：8.610；GSE27155隊(duì)列：2.968；GSE3467隊(duì)列：8.142；GSE6004隊(duì)列：9.869)，TPST1 mRNA在THCA隊(duì)列(7.883，P<0.001)、GSE27155隊(duì)列(2.717，P=0.005)、GSE3467隊(duì)列(7.393，P=0.008)和GSE6004隊(duì)列(9.217，P=0.012)的癌組織中均表達(dá)顯著下調(diào)(圖1)。

圖1 TPST1 mRNA的表達(dá)：THCA(A)、GSE27155(B)、GSE3467(C)和GSE6004(D)隊(duì)列中，比較TPST1 mRNA在正常甲狀腺組織和甲狀腺乳頭狀癌組織的表達(dá)

2.2 甲狀腺癌中TPST1 mRNA表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系本實(shí)驗(yàn)分析THCA隊(duì)列中有504例甲狀腺癌中TPST1 mRNA與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示：TPST1 mRNA與病理分期(P=0.029，r=-0.10)、T分期(P<0.001，r=-0.215)、N分期(P<0.001，r=-0.213，表1)等呈負(fù)相關(guān)。TPST1 mRNA高表達(dá)組的無瘤生存期(P=0.003)和無進(jìn)展生存期(P=0.009)顯著高于低表達(dá)組；但總生存率(P=0.261)和疾病特異生存率(P=0.156)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖2 TPST1 mRNA與甲狀腺乳頭狀癌患者的預(yù)后分析：A無瘤生存期；B.無進(jìn)展生存期

表1 甲狀腺乳頭狀癌中TPST1 mRNA與臨床病理特征的相關(guān)性

2.3 甲狀腺癌中TPST1蛋白的表達(dá)免疫組化檢測TPST1蛋白在16例甲狀腺乳頭狀癌組織和16例對照組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示：TPST1主要定位于細(xì)胞質(zhì)，TPST1在甲狀腺乳頭狀癌組(2.000±0.2415)中的表達(dá)顯著低于對照組(2.813±0.2918，P=0.040，圖3、4)。

圖3 TPST1蛋白在組織中的表達(dá)，EnVision法：A.正常甲狀腺組織；B.甲狀腺乳頭狀癌組織

2.4 TPST1共表達(dá)基因及其功能生物信息學(xué)分析篩選TPST1共表達(dá)基因976個(gè)，其中呈正相關(guān)有MAGEH1、FHL1和TIMP3等686個(gè)基因(P<0.05，r>0.40)，呈負(fù)相關(guān)有CDK16、FN1和MET等290個(gè)(P<0.05，r<-0.4)基因。GO分析發(fā)現(xiàn)，這些基因的分子功能主要是蛋白酶結(jié)合、鈣黏蛋白結(jié)合參與細(xì)胞與細(xì)胞的黏附、細(xì)胞黏附分子結(jié)合、磷酸酶結(jié)合等。參與的生物學(xué)過程主要是MAP激酶活性的調(diào)控、血管內(nèi)皮生長因子信號通路、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)控、調(diào)節(jié)GTPase的活性等。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用4個(gè)獨(dú)立的甲狀腺乳頭狀癌隊(duì)列合計(jì)663例樣本，比較TPST1在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)水平。大樣本和多隊(duì)列充分論證TPST1 mRNA在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)顯著下調(diào)。免疫組化也證實(shí)TPST1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)下調(diào)。TPST1可能是甲狀腺乳頭狀癌的潛在標(biāo)志物。另外，TPST1與病理分期、T分期和N分期等呈負(fù)相關(guān)，提示其表達(dá)下調(diào)，可能與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展有關(guān)。最后TPST1高表達(dá)組患者的無瘤生存期和無進(jìn)展生存期顯著高于低表達(dá)組，提示TPST1表達(dá)水平與患者預(yù)后有關(guān)，與Jiang等[5]在肺癌中的分析一致。本實(shí)驗(yàn)提示TPST1基因表達(dá)下調(diào)，可能與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有關(guān)。

圖4 TPST1蛋白在不同組織中表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本組為揭示TPST1在甲狀腺乳頭狀癌的中潛在分子機(jī)制，生物信息學(xué)篩選976個(gè)與TPST1相關(guān)的差異表達(dá)基因，這些基因中MAGEH1與細(xì)胞凋亡、周期阻滯和生長抑制有關(guān)，其表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)肝癌的進(jìn)展[7]。FHL1是腫瘤抑制基因，可抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[8]。TIMP3是基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制劑，可抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。CDK16在多種腫瘤中高表達(dá)，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、遷移、侵襲、凋亡[10]。FN1能促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[11]。MET在多種腫瘤中過表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)[12]。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，TPST1與血管內(nèi)皮生長因子信號通路、細(xì)胞的黏附等生物學(xué)功能有關(guān)。因此，TPST1可能與上述基因和生物功能共同影響甲狀腺乳頭狀癌的惡性生物行為，還有待于進(jìn)一步分析。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TPST1對甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展可能具有一定的影響，有望成為甲狀腺乳頭狀癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。