張繼方，呂慶杰

卵巢癌是惡性程度和病死率較高的婦科腫瘤，其中漿液性卵巢癌(serous ovarian cancer, SOC)是最常見(jiàn)的卵巢上皮性惡性腫瘤[1]。多數(shù)患者在疾病進(jìn)展期時(shí)被發(fā)現(xiàn)，卵巢癌晚期患者的主要治療方法為腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)并輔以鉑類(lèi)和紫杉醇聯(lián)合化療[2]。在臨床治療中化療耐藥頻繁發(fā)生。因此，尋找預(yù)測(cè)耐藥的生物學(xué)標(biāo)志物，對(duì)延長(zhǎng)患者生存期具有重要價(jià)值。G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白2(G-protein signaling modulator 2, GPSM2)屬于調(diào)節(jié)G蛋白激活的蛋白家族，通過(guò)調(diào)節(jié)紡錘體的定向運(yùn)動(dòng)維持細(xì)胞的對(duì)稱(chēng)性分裂。研究發(fā)現(xiàn)，GPSM2與惡性腫瘤關(guān)系密切，然而GPSM2在卵巢癌中的作用尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)探討GPSM2在SOC中的表達(dá)，并進(jìn)一步分析GPSM2與化療耐藥及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料選取2012年1月～2014年12月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科存檔的SOC石蠟標(biāo)本131例以及同期漿液性囊腺瘤、交界性漿液性囊腺瘤、正常卵巢及輸卵管石蠟標(biāo)本各15例，該分組標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[3]。其中SOC患者年齡25～76歲，平均51.8歲，中位年齡51歲。按FIGO(2016)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床病理分期：Ⅰ+Ⅱ期38例，Ⅲ+Ⅳ期93例；腫瘤組織學(xué)分級(jí)：G1+G2級(jí)59例，G3級(jí)72例。另收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院行手術(shù)切除的新鮮SOC、正常卵巢、輸卵管組織各10例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均為原發(fā)性SOC患者；(2)均實(shí)施腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)；(3)術(shù)前未接受放、化療；(4)術(shù)后化療方案為紫杉醇聯(lián)合鉑類(lèi)治療。根據(jù)NCCN指南化療敏感組為首次采用鉑類(lèi)與紫杉醇聯(lián)合為主的化療方案后臨床上獲得緩解，完成化療周期，停藥6個(gè)月以?xún)?nèi)無(wú)復(fù)發(fā)；化療耐藥組為首次采用鉑類(lèi)與紫杉醇聯(lián)合為主的化療方案后臨床上獲得緩解，完成化療周期，在化療過(guò)程中或停藥6個(gè)月以?xún)?nèi)復(fù)發(fā)。臨床上卵巢癌復(fù)發(fā)的主要依據(jù)：血清CA125水平進(jìn)行性升高，伴發(fā)胸腹水，影像學(xué)檢查證實(shí)有復(fù)發(fā)病灶，原因不明確的腸梗阻。所納入的SOC患者合計(jì)131例，在化療結(jié)束后以電話(huà)、門(mén)診或電子病歷等方式進(jìn)行追蹤，其中死亡73例，失訪13例，隨訪率為90.1%。隨訪時(shí)間6～60個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為46個(gè)月。疾病無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival, PFS)是從化療開(kāi)始到疾病復(fù)發(fā)或死亡時(shí)間，總生存期(overall survival, OS)是從手術(shù)后第一天至死亡時(shí)間。本組中位PFS和中位OS分別為20個(gè)月和51個(gè)月。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化SP法染色，切片厚約4 μm，二甲苯脫臘，梯度乙醇(100%、95%、75%)水化?？乖迯?fù)5 min(pH 6.0檸檬酸鹽修復(fù)液)，滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑封閉，室溫孵育10 min，滴加一抗(工作濃度為1 ∶200)，4 ℃過(guò)夜。次日，滴加二抗，室溫孵育20 min，各步驟之間用PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min。DAB顯色2 min，沖洗，蘇木精復(fù)染2 min，中性樹(shù)膠封固。以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。GPSM2兔抗人多克隆抗體購(gòu)自Proteintech公司，通用型試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2.2RT-PCR 利用Trizol試劑盒提取總RNA，分光光度計(jì)測(cè)量RNA的濃度和純度。應(yīng)用Prime Script RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司，大連)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板對(duì)引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。GPSM2上游引物序列：5′-GACAAGGTGGGAGAAGCAAGAGC-3′、下游引物序列：5′-GGGGACCAGGGCAACCAAAAC-3′，GAPDH為內(nèi)參照。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，預(yù)變性；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，合計(jì)45個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min。表達(dá)水平根據(jù)2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.3 結(jié)果判讀GPSM2表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)。按陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項(xiàng)評(píng)分結(jié)果相乘為最終評(píng)分：0～2分為陰性(-)，3～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為中度陽(yáng)性()，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性()。通過(guò)繪制ROC曲線(xiàn)，進(jìn)而確定Cut off值為9。本實(shí)驗(yàn)將評(píng)分≥9分為高表達(dá)，<9分為低表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法閱片控制誤差率。

2 結(jié)果

2.1 SOC中GPSM2的表達(dá)GPSM2主要表達(dá)于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)，在卵巢良性腫瘤、交界性卵巢腫瘤、正常卵巢及輸卵管組織中主要呈低表達(dá)或無(wú)表達(dá)，131例SOC中111例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為84.7%(圖1、2)。SOC組與其他三組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表1)。

圖1 A.正常卵巢中GPSM2的表達(dá)，SP法；B.正常輸卵管中GPSM2的表達(dá)，SP法；C.卵巢良性腫瘤中GPSM2的表達(dá)，SP法；D.交界性卵巢腫瘤中GPSM2的表達(dá)，SP法 圖2 A.SOC中GPSM2呈陰性，SP法；B.SOC中GPSM2呈弱陽(yáng)性，SP法；C.SOC中GPSM2呈中度陽(yáng)性，SP法；D.SOC中GPSM2呈強(qiáng)陽(yáng)性，SP法

表1 卵巢、輸卵管、卵巢良性腫瘤、交界性卵巢腫瘤、SOC中GPSM2的表達(dá)

2.2 SOC中GPSM2 mRNA的表達(dá)本組檢測(cè)10例正常輸卵管、10例正常卵巢和10例SOC新鮮標(biāo)本的GPSM2 mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示：GPSM2 mRNA在SOC中的表達(dá)量(1.75±0.15)高于卵巢(1.1 ± 0.16)和輸卵管(1±0.13)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3)；卵巢和輸卵管的GPSM2 mRNA表達(dá)量差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

圖3 GPSM2 mRNA在正常輸卵管、正常卵巢、SOC中的相對(duì)表達(dá)量

2.3 化療耐藥組與化療敏感組中GPSM2蛋白表達(dá)差異131例SOC標(biāo)本按NCCN指南對(duì)化療耐藥的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類(lèi)，其中41例為化療耐藥組，90例為化療敏感組。本組對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，化療耐藥組高表達(dá)率為58.5%，化療敏感組高表達(dá)率為35.6%。由于兩組評(píng)分結(jié)果不滿(mǎn)足正態(tài)分布，通過(guò)兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行比較，結(jié)果表明化療耐藥組GPSM2蛋白的表達(dá)水平高于化療敏感組(P=0.032，表2，圖4)。

圖4 GPSM2在化療耐藥組和化療敏感組中的免疫組化評(píng)分

表2 化療耐藥組與化療敏感組GPSM2的免疫組化評(píng)分比較

2.4 SOC中GPSM2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系本組結(jié)果顯示，SOC中Ⅲ+Ⅳ期組GPSM2的高表達(dá)率為48.4%，顯著高于Ⅰ+Ⅱ期的28.9%(P=0.028)?；熌退幗MGPSM2的高表達(dá)率為58.5%，明顯高于化療敏感組的35.6%(P=0.014)，GPSM2表達(dá)與患者年齡、病理分級(jí)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹水量、CA125表達(dá)水平、殘余病灶、腫瘤大小無(wú)相關(guān)性(表3)。

表3 SOC中GPSM2表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

2.5 GPSM2表達(dá)與SOC患者預(yù)后的關(guān)系使用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)分析GPSM2與PFS和OS的相關(guān)性。GPSM2高表達(dá)組患者的1、3、5年的累積生存率分別為76%、44%、22%，GPSM2低表達(dá)組患者的1、3、5年的累積生存率分別為90%、68%、52%。本組結(jié)果顯示：GPSM2表達(dá)水平與SOC患者的OS(P<0.001)和PFS(P=0.018)均顯著相關(guān)，GPSM2蛋白高表達(dá)提示SOC患者預(yù)后較差(圖5)。

圖5 GPSM2的表達(dá)水平與SOC預(yù)后的相關(guān)性：A.PFS分析；B.OS分析

2.6 SOC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素本組各因素與PFS的單因素分析中，GPSM2表達(dá)水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、殘余病灶、腹水量、FIGO分期、CA125水平與PFS顯著相關(guān)，由于FIGO分期已經(jīng)包括腹水、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，剩余因素納入Cox多因素分析，結(jié)果顯示GPSM2(HR：1.481，95%CI：1.008～2.177，P=0.046)與FIGO分期(HR：3.277，95%CI：1.914～5.609，P<0.001)為預(yù)測(cè)PFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表4)。

表4 各變量與PFS的Cox單因素和多因素分析

本組各因素與OS的單因素分析中，GPSM2表達(dá)、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、殘余病灶、腹水量、FIGO分期、CA125水平與OS顯著相關(guān)，由于FIGO分期包括腹水、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，剩余因素納入Cox多因素分析，結(jié)果顯示GPSM2(HR：1.877，95%CI：1.165～3.023，P=0.01)與FIGO分期(HR：3.346，95%CI：1.613～6.942，P<0.001)是評(píng)估SOC患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表5)。

表5 各變量與OS的Cox單因素和多因素分析

3 討論

女性卵巢癌的惡性程度較高，5年生存率約為40%，造成卵巢癌預(yù)后差的關(guān)鍵因素是化療耐藥[4-5]。因此，尋找預(yù)測(cè)化療耐藥的腫瘤標(biāo)志物對(duì)延長(zhǎng)卵巢癌患者的生存期有積極的意義。

GPSM2屬于G蛋白偶聯(lián)受體的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，調(diào)控有絲分裂過(guò)程中紡錘體的正確定位[6]，維持對(duì)稱(chēng)性分裂，在G2/M期發(fā)揮重要作用[7-8]。GPSM2也受多種調(diào)節(jié)因子的調(diào)控，并通過(guò)與不同因子的相互作用，共同影響紡錘體的定位[9]。

本實(shí)驗(yàn)從mRNA和蛋白水平分別檢測(cè)GPSM2的表達(dá)，結(jié)果顯示其在SOC中高表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與GPSM2在肝癌、乳腺癌和胰腺癌組織中的高表達(dá)一致[10-15]，提示GPSM2與癌癥的發(fā)生緊密相關(guān)。

卵巢癌臨床治療的一線(xiàn)化療方案為鉑類(lèi)與紫杉醇聯(lián)合化療，紫杉醇是一類(lèi)抗微管藥物，使細(xì)胞分裂

在G2/M期停滯[16-17]，研究證實(shí)阻滯于G2/M期的細(xì)胞有明顯的凋亡傾向[18]，近年GPSM2與腫瘤的文獻(xiàn)報(bào)道較多，乳腺癌相關(guān)文獻(xiàn)表明[10-11]GPSM2在G2/M期表達(dá)上調(diào)，且GPSM2高表達(dá)與紫杉醇化療敏感性顯著相關(guān)。敲除GPSM2，紫杉醇誘導(dǎo)G2期阻滯減少，紫杉醇可能通過(guò)抑制GTP活性使誘導(dǎo)周期停滯的能力下降，從而導(dǎo)致患者產(chǎn)生耐藥性。以上表明，G2期停滯和微管調(diào)節(jié)可能是GPSM2的潛在機(jī)制。

乳腺和卵巢同屬雌孕激素依賴(lài)性器官，可能具有同源性。本實(shí)驗(yàn)分析GPSM2在SOC化療耐藥的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)耐藥組GPSM2的表達(dá)水平高于敏感組，提示GPSM2高表達(dá)可能會(huì)減弱SOC患者對(duì)化療藥物的敏感性，但GPSM2在乳腺癌和卵巢癌中對(duì)化療藥物產(chǎn)生不同的效應(yīng)，也許是由于器官的異質(zhì)性導(dǎo)致GPSM2在不同腫瘤中的差異表現(xiàn)，也許是由于未考慮到鉑類(lèi)耐藥。

此外，生存分析發(fā)現(xiàn)GPSM2高表達(dá)與SOC患者較差的OS和PFS顯著相關(guān)。多因素生存分析發(fā)現(xiàn)，GPSM2、FIGO分期可以作為預(yù)測(cè)OS和PFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與高臨床分期、化療耐藥的SOC患者往往有更差的預(yù)后相符。另外，在胰腺癌[12-13]和肝癌[14]中，上調(diào)GPSM2的表達(dá)能增加細(xì)胞的遷移和侵襲能力，提示GPSM2高表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，對(duì)患者預(yù)后不佳。

綜上所述，GPSM2與SOC發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，GPSM2可能是評(píng)估化療療效和預(yù)后的重要指標(biāo)。由于本實(shí)驗(yàn)對(duì)GPSM2與化療藥物的潛在機(jī)制了解不足，可能限制了對(duì)兩者內(nèi)在聯(lián)系的深入探討，尚待更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析。