景桂英，鄭炫針，季曉霞，錢 余

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。據(jù)估計(jì)2018年全球有超過(guò)180萬(wàn)CRC新發(fā)病例和88.1萬(wàn)CRC患者死亡，約占全部惡性腫瘤的1/10[1]。近年CRC診斷及治療水平不斷進(jìn)步，但難治性、轉(zhuǎn)移性CRC發(fā)生率仍較高，且CRC患者總生存率并未得到有效改善[2]。目前，某些生物學(xué)標(biāo)志物已被證實(shí)與CRC的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后顯著相關(guān)，例如癌胚抗原CA19-9和CA72-5可用于檢測(cè)CRC患者復(fù)發(fā)[3]；p53或KRAS基因的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和突變已被用作CRC預(yù)后的預(yù)測(cè)因素[4]。然而上述生物學(xué)標(biāo)志物的可靠性仍存在爭(zhēng)議，因此開(kāi)發(fā)新的CRC診斷和預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物以及治療靶標(biāo)是臨床迫切的需求。RNA結(jié)合基序蛋白3(RNA-binding motif protein 3, RBM3)屬于富含甘氨酸的蛋白，在結(jié)構(gòu)上具有能夠與RNA和DNA結(jié)合的RNA識(shí)別基序。RBM3是重要的冷應(yīng)激蛋白，環(huán)境刺激如體溫過(guò)低、局部缺血和缺氧可以增加其表達(dá)[5]。在前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌和膀胱癌等癌細(xì)胞中，RBM3表達(dá)的上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞分化并防止細(xì)胞凋亡[5-6]，但其在CRC中的研究并不多見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化SP法檢測(cè)CRC組織中RBM3表達(dá)，探討其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為CRC診斷和預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2014年1月1日～2018年12月31日上海市楊浦區(qū)控江醫(yī)院病理科存檔的CRC根治術(shù)切除的石蠟標(biāo)本150例。所有病例均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)診斷為原發(fā)性腺癌，且術(shù)前均未行放、化療等抗腫瘤治療。150例CRC中男性89例，女性61例，平均年齡(64.29±13.80)歲。腫瘤直徑≥5 cm者62例，<5 cm者88例。腫瘤部位：結(jié)腸120例，直腸30例。腫瘤浸潤(rùn)深度：T1期9例，T2期27例，T3期94例，T4期20例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者55例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者95例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者43例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者107例。根據(jù)2016年美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)/國(guó)際抗癌聯(lián)盟(AJCC/UICC)制定的TNM分期進(jìn)行分類：Ⅰ期30例，Ⅱ期35例，Ⅲ期67例，Ⅳ期18例。另收集在我院體檢行腸鏡活檢的正常結(jié)直腸黏膜組織石蠟標(biāo)本46例，其中男性21例，女性25例，平均年齡(68.39±14.63)歲。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法免疫組化染色采用SP法，取CRC組織和正常結(jié)直腸黏膜組織石蠟標(biāo)本，4 μm厚連續(xù)切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇梯度水化。檸檬酸緩沖液高溫修復(fù)抗原，3%H2O2孵育10 min，加入10%山羊血清封閉10 min。加入1 ∶500稀釋的兔抗人RBM3單克隆抗體(購(gòu)自Abcam公司)4 ℃過(guò)夜孵育，次日加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體(購(gòu)自北京中杉金橋公司)。PBS沖洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明，封固，鏡下觀察。

1.3 結(jié)果判斷由兩位高年資病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(400×)計(jì)數(shù)細(xì)胞。RBM3蛋白表達(dá)以細(xì)胞核呈棕黃或棕褐色顆粒為陽(yáng)性。按細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，黃色或深黃色為2分，棕黃或棕褐色為3分。按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為0分，10%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。兩者相乘即為總評(píng)分，兩位病理醫(yī)師所得的總評(píng)分取平均分即為最終評(píng)分，其中0～6分為RBM3蛋白低表達(dá)，6～12分為RBM3蛋白高表達(dá)[7-8]。

1.4 隨訪通過(guò)門診復(fù)查或電話訪問(wèn)對(duì)所有CRC患者進(jìn)行隨訪，以患者行CRC根治術(shù)時(shí)間作為起始時(shí)間，以CRC患者死亡為終點(diǎn)事件，隨訪截止時(shí)間為2020年3月31日。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料如RBM3蛋白低表達(dá)與高表達(dá)者的臨床病理特征比較采用χ2檢驗(yàn)，RBM3蛋白不同表達(dá)水平CRC患者生存率的比較采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC和正常結(jié)直腸黏膜組織中RBM3蛋白表達(dá)150例CRC組織中RBM3蛋白高表達(dá)率為34.0%(51/150)，46例正常結(jié)直腸黏膜組織中RBM3蛋白高表達(dá)率為69.6%(32/46)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.239，P<0.001，圖1)。

圖1 A.正常結(jié)直腸黏膜組織中RBM3高表達(dá)，SP法；B.CRC組織中RBM3低表達(dá)，SP法；C.CRC組織中RBM3中度表達(dá)，SP法；D.CRC組織中RBM3高表達(dá)，SP法

2.2 CRC中RBM3蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系RBM3蛋白高表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤直徑、發(fā)病部位無(wú)關(guān)(P均>0.05)，而與腫瘤浸潤(rùn)深度(χ2=5.404，P=0.020)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=4.157，P=0.041)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(χ2=4.589，P=0.032)和TNM分期(χ2=5.760，P=0.016)均呈負(fù)相關(guān)(表1)。

表1 CRC中RBM3蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 RBM3蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，RBM3蛋白高表達(dá)的CRC患者生存時(shí)間為(53.24±2.47)個(gè)月，而低表達(dá)者生存時(shí)間為(44.39±2.59)個(gè)月。經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)可知RBM3蛋白高表達(dá)的CRC患者生存率顯著高于低表達(dá)者(χ2=4.128，P=0.042，圖2)。

圖2 CRC中RBM3蛋白表達(dá)與患者生存期的關(guān)系

3 討論

CRC作為一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多因素和多階段的復(fù)雜過(guò)程，其中一個(gè)主要因素是抑癌基因與原癌基因的缺失、錯(cuò)位、突變的積累效應(yīng)。RBM3基因位于人染色體Xp11.23，編碼含157個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，RBM3蛋白是重要的冷應(yīng)激蛋白，其表達(dá)量在受到冷刺激時(shí)上調(diào)。RBM3的主要生物學(xué)功能是介導(dǎo)冷誘導(dǎo)下細(xì)胞抗凋亡的保護(hù)作用，參與缺氧應(yīng)激、細(xì)胞增殖等生理過(guò)程，還可以作為原癌基因在生物學(xué)過(guò)程中充當(dāng)調(diào)控因子。RBM3通常被認(rèn)為是潛在的原癌基因，主要有以下原因：(1)RBM3表達(dá)水平與腫瘤分期密切相關(guān)，表明其可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)；(2)RBM3基因沉默可以增加G2/M期的細(xì)胞數(shù)量，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；(3)RBM3可改善COX-2、IL-8和VEGF mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率[9]。此外，RBM3可直接與mRNA結(jié)合，改變mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并影響mRNA起始因子進(jìn)入核糖體亞基的作用，從而調(diào)節(jié)腫瘤中激酶的潛在活性。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化SP法發(fā)現(xiàn)CRC組織中RBM3蛋白高表達(dá)率顯著低于正常結(jié)直腸黏膜組織，且通過(guò)分析RBM3表達(dá)與CRC臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)RBM3高表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度(T3+T4)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N1+N2)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M1)和TNM分期(Ⅲ+Ⅳ)呈負(fù)相關(guān)，提示RBM3在CRC發(fā)生、發(fā)展中可能是候選抑癌基因。Wnt/β-catenin信號(hào)通路失調(diào)是控制CRC侵襲性和腫瘤干細(xì)胞活性的關(guān)鍵因素。約80%的散發(fā)性和遺傳性的CRC是由于APC基因和β-catenin基因突變引起Wnt/β-catenin通路過(guò)度激活造成的。RBM3過(guò)表達(dá)導(dǎo)致GSK3β磷酸化，從而減弱β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)，并最終抑制CRC的發(fā)生、發(fā)展[10]。前期研究表明不同類型的癌癥之間RBM3表達(dá)的生物學(xué)和臨床意義有所不同。如與正常組織相比，RBM3在胃癌、前列腺癌和乳腺癌組織中的表達(dá)增加，但相對(duì)于非癌組織，RBM3在惡性黑色素瘤、CRC和膀胱癌組織中的表達(dá)降低。另外，Chen等[11]報(bào)道RBM3以正向方式調(diào)節(jié)ARPC2，并且通過(guò)轉(zhuǎn)錄后3′UTR結(jié)合監(jiān)測(cè)調(diào)節(jié)作用，這種結(jié)合可介導(dǎo)RBM3在乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖中的關(guān)鍵作用。Dong等[12]發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA SCD-circRNA 2可能在RBM3的下游靶分子中起作用，從而影響肝細(xì)胞癌的進(jìn)展。本組推測(cè)這些不同分析結(jié)果，可能是由于在單個(gè)器官中RBM3與其他被激活和表達(dá)的基因之間相互作用造成的。

本實(shí)驗(yàn)采用Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)RBM3蛋白高表達(dá)的CRC患者生存率顯著高于低表達(dá)者，提示RBM3高表達(dá)與CRC患者術(shù)后良好預(yù)后相關(guān)。近期研究發(fā)現(xiàn)RBM3過(guò)表達(dá)與乳腺癌、CRC、黑色素瘤、胃癌、肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌和睪丸癌的預(yù)后改善有關(guān)；相反，其過(guò)表達(dá)與膀胱癌和前列腺癌的總生存期較差相關(guān)；Melling等[13]評(píng)估Ⅰ～Ⅲ期原發(fā)性CRC中RBM3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RBM3高表達(dá)與總生存期長(zhǎng)有關(guān)，且在原發(fā)性CRC中發(fā)現(xiàn)RBM3核表達(dá)是最強(qiáng)的預(yù)后因素。Jonsson等[14]發(fā)現(xiàn)RBM3在黑色素瘤發(fā)展過(guò)程中表達(dá)丟失，并且是預(yù)測(cè)患者總生存期延長(zhǎng)的獨(dú)立生物學(xué)標(biāo)志物。在一項(xiàng)納入11 152例前列腺癌患者的研究中，RBM3高表達(dá)被證實(shí)與腫瘤晚期、Gleason評(píng)分高、淋巴結(jié)受累和手術(shù)切緣陽(yáng)性呈正相關(guān)；在包括RBM3高表達(dá)、Gleason評(píng)分、腫瘤分期、前列腺特異性抗原、手術(shù)切緣和淋巴結(jié)狀態(tài)在內(nèi)的多因素分析中，RBM3高表達(dá)對(duì)術(shù)后預(yù)后的影響仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008 4)，可見(jiàn)RBM3高表達(dá)是前列腺癌術(shù)后不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[15]。

總之，RBM3蛋白高表達(dá)與CRC發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的不良事件如腫瘤浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等呈負(fù)相關(guān)，且與CRC預(yù)后良好有關(guān)。分析RBM3在CRC中的臨床病理學(xué)意義和預(yù)后價(jià)值，有助于理解CRC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，有望為CRC診斷、靶向治療和預(yù)后評(píng)估提供新靶點(diǎn)。