馮 琨，楊 堃，宋海云，王鴻宇，姜慧峰，李秋堯

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球常見的惡性腫瘤之一，在東亞及非洲國家發(fā)病率較高，西方國家也呈逐年攀升趨勢。HCC患者確診時多為中晚期，預(yù)后較差，多數(shù)文獻報道患者出現(xiàn)臨床癥狀時其5年生存率低于5%[1]。碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA)屬于鋅離子金屬蛋白酶，廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)，催化CO2水解為重碳酸鹽和質(zhì)子，CAⅨ是其重要一員[2]。CAⅨ的表達主要是在缺氧環(huán)境下，其位于Von Hippel-Lindau綜合征(簡稱VHL綜合征)腫瘤抑制基因的下游，由HIF-1α調(diào)節(jié)[3]。其在正常人體組織中主要表達于胃腸等消化道中，在多種人類惡性腫瘤如腎細胞癌、肺癌、結(jié)直腸癌、膽囊癌、胃食管癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘤及軟組織肉瘤等均證實其存在過表達，并與腫瘤的惡性進展密切相關(guān)。本實驗通過檢測HCC及癌旁組織中CAⅨ的表達，分析其與HCC病理分化程度及預(yù)后的關(guān)系，并進一步通過細胞實驗探討CAⅨ與肝癌細胞增殖和侵襲的關(guān)系，為HCC的診斷、治療及預(yù)后評估尋找新的分子標志物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2014年1月～2019年12月山東大學(xué)齊魯醫(yī)院(青島)病理科存檔的HCC 67例及癌旁對應(yīng)肝組織石蠟標本。男性47例，女性20例，年齡38～79歲，平均58歲，術(shù)前均未接受其他治療。依據(jù)HCC的Edmondson分級，將其分為3組：高分化組/Ⅰ級(20例)、中分化組/Ⅱ級(27例)、低分化組/Ⅲ+Ⅳ級(20例)。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片，分別行HE及免疫組化LDP法染色。一抗兔抗單克隆抗體CAⅨ購自北京中杉金橋公司；二抗山羊抗兔/鼠購自美國羅氏公司。石蠟切片常規(guī)脫蠟，枸櫞酸高壓修復(fù)2 min，室溫冷卻后PBS液洗3次×3 min，3%H2O2去離子水常溫10 min滅活內(nèi)源性過氧化氫酶活性，PBS沖洗3次×3 min，滴加一抗，37 ℃恒溫箱中孵育60 min，PBS沖洗3次×3 min，滴加二抗，37 ℃恒溫箱中孵育15 min，PBS沖洗3次×3 min，DAB顯色5 min，蘇木精復(fù)染3 min，流水沖洗5 min，1%鹽酸乙醇分色10 s，自來水(堿性)流水沖洗5 min，梯度乙醇脫水，透明，封固。PBS代替一抗作為空白對照。高倍鏡下每張切片選擇10個有代表性的視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞，合計1 000個細胞。CAⅨ蛋白陽性定位于細胞膜，呈黃色，無背景著色。(1)按陽性細胞染色強度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；(2)按陽性細胞百分率計分：陽性細胞數(shù)≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～49%為2分，≥50%為3分。將兩項得分結(jié)果相乘：0～3分為陰性(-)，4～9分為陽性(+)。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染 人肝癌細胞株HepG2購于美國細胞庫(ATCC)。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、TR-脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、TR-Izol(Invitrogen，USA)；PrimeScripts RT Reagent Kit(Takara Bio Inc，Japan)；CCK-8(Dojindo，Kumamoto, Japan)；Transwell Flters (Millipore，USA)；RPMI 1640、Opti-MEMI培養(yǎng)液和胎牛血清(Gibco，USA)。CAⅨ過表達載體、干擾表達的siRNA以及CAⅨ引物由廣州銳博公司設(shè)計與合成。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染。實驗分為陰性對照組(只有脂質(zhì)體)、CAⅨ過表達組(CAⅨ過表達載體和脂質(zhì)體)和CAⅨ干擾表達組(加入CAⅨ siRNA濃度為100 nmol/L和脂質(zhì)體)。轉(zhuǎn)染成功后于37 ℃ 5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中48 h，收集細胞進行各項檢測。

1.2.3qRT-PCR檢測 提取各組細胞中的總RNA；采用PrimeScripts RT Reagent Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；采用qRT-PCR技術(shù)檢測CAⅨ在肝癌細胞株HepG2中的表達水平。每一樣品重復(fù)3次，以U6作為內(nèi)參，記錄Ct值。定量PCR反應(yīng)程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min預(yù)變性(1個循環(huán))；95 ℃ 15 s，65 ℃1 min，合計40個循環(huán)。各組間CAⅨ相對定量的倍數(shù)用2-△△Ct值表示。

1.2.4CCK-8法檢測 將CAⅨ過表達載體及siRNA轉(zhuǎn)染入HepG2細胞。脂質(zhì)體為陰性對照組，細胞接種于96孔板(2 000個/孔)，在37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用CCK-8試劑檢測0、24、48、72、96 h細胞增殖數(shù)目的變化。

1.2.5細胞劃痕法檢測肝癌細胞株遷徙能力 將轉(zhuǎn)染后的HepG2細胞分別培養(yǎng)于6孔板中，直到板孔被細胞覆蓋，用200 μL移液器槍頭刮1個直徑約200 μm的垂直劃痕，PBS沖洗3次，37 ℃孵育。24 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞平均遷徙面積，每組實驗重復(fù)3次。

1.2.6Transwell法檢測肝癌細胞株侵襲能力 按照Milipore公司Transwell小室說明書操作，于100 μL基質(zhì)膠中以1 ∶8稀釋的無血清培養(yǎng)基中過夜孵育。常規(guī)培養(yǎng)12～16 h，10%中性福爾馬林固定細胞2 h，1%結(jié)晶紫染色，隨機選5個視野計數(shù)，倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.3 隨訪HCC患者隨訪以確診之日始，以2020年7月截止，以腫瘤復(fù)發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移或死亡為終止事件。采用電話、門診、住院等方式進行隨訪。隨訪過程中記錄復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的部位、時間和死亡患者的時間及具體原因。觀察患者的手術(shù)情況，并于術(shù)后每3個月復(fù)查上腹部MRI/CT、彩超、血液檢驗(主要為甲胎蛋白、肝功能及乙肝病毒復(fù)制)等評估療效；計算患者總生存率并進行生存分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，CAⅨ蛋白表達與臨床病理分型的相關(guān)性分析采用四格表χ2檢驗或行×列表χ2檢驗；3組定量數(shù)據(jù)對比先采用單因素方差分析，再行SNK-q或LSD-t檢驗，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用方差分析；采用Kaplan-Meier法生存曲線分析，并利用Log-rank檢驗分析差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5 數(shù)據(jù)庫分析使用UALCAN網(wǎng)站(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)檢索TCGA數(shù)據(jù)庫中關(guān)鍵詞HCC與CAⅨ并進行分析，對本實驗數(shù)據(jù)進行補充驗證。

2 結(jié)果

2.1 HCC組織中CAⅨ的表達HCC組織中CAⅨ主要表達于癌細胞的胞膜，內(nèi)對照為周圍正常小膽管。67例HCC中24例陽性，43例陰性，陽性率為35.8%(24/67)；67例癌旁正常肝組織中CAⅨ均陰性。HCC中CAⅨ表達高于癌旁正常組織(χ2=29.236，P<0.05，表1，圖1)。HCC按分化程度分為高、中、低分化組，免疫組化檢測結(jié)果顯示，CAⅨ蛋白的陽性率在高分化組中為10.0%(2/20)，在中分化組中為29.6%(8/27)，在低分化組中為70.0%(14/20)，陽性率隨著腫瘤分化的降低而升高，各組之間有明顯差異(χ2=16.413，P<0.05，表2)。上述結(jié)果表明CAⅨ表達上調(diào)與HCC的發(fā)生及分化程度相關(guān)。

表1 HCC與癌旁組織中CAⅨ的表達

表2 HCC不同分化程度分組中CAⅨ的表達

圖1 A.CAⅨ在HCC組中呈陽性，LDP法；B.CAⅨ在癌旁組織中呈陰性，陽性為內(nèi)對照，LDP法

2.2 預(yù)后生存分析截至2020年7月，67例患者均從住院或門診復(fù)查獲得信息資料。隨訪時間2～76個月，中位隨訪時間17個月。根據(jù)CAⅨ不同表達分組進行生存分析，結(jié)果提示CAⅨ陽性肝癌患者17個月總生存率為51.0%，CAⅨ陰性肝癌患者17個月總生存率為90.9%。Kaplan-Meier生存分析顯示，CAⅨ陽性和陰性患者的總生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.772，P<0.05，圖2)。收集TCGA數(shù)據(jù)庫中365例HCC患者，CAⅨ miRNA高表達90例，CAⅨ miRNA低/中等表達275例，Kaplan-Meier生存分析顯示CAⅨ miRNA高表達的HCC患者總生存率低于低/中等表達者(P=0.000 45，圖3)。

圖2 CAⅨ表達與HCC患者總生存率的關(guān)系

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫中CAⅨ miRNA表達與HCC患者預(yù)后的關(guān)系

2.3 CAⅨ在轉(zhuǎn)染后人肝癌細胞株HepG2中的表達HepG2細胞株轉(zhuǎn)染CAⅨ過表達和干擾表達的siRNA 48 h后，qRT-PCR檢測顯示CAⅨ過表達組在HepG2細胞株中呈高表達，CAⅨ干擾表達組在細胞株中呈低表達，與陰性對照組相比差異均有顯著性(P<0.05，圖4)。

圖4 CAⅨ在轉(zhuǎn)染后人肝癌細胞株HepG2中的表達

2.4 過表達及低表達CAⅨ對肝癌細胞增殖能力的影響由HepG2細胞生長曲線可見，轉(zhuǎn)染48 h后，CAⅨ過表達組細胞的生長受到明顯促進，而CAⅨ干擾表達組受到明顯抑制，在96 h兩組的作用效果最為明顯(圖5)。提示CAⅨ的表達水平與肝癌細胞HepG2的增殖能力相關(guān)，siRNA干擾沉默HepG2細胞中CAⅨ的表達會抑制其增殖生長。

圖5 CAⅨ過表達及干擾表達組對肝癌細胞增殖能力的影響

2.5 過表達及低表達CAⅨ對肝癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響遷移實驗結(jié)果顯示，CAⅨ過表達組比陰性對照組細胞二維水平遷移速度明顯提高(P<0.05)，而CAⅨ干擾表達組比陰性對照組細胞二維水平遷移速度明顯降低(P<0.05，圖6)。侵襲實驗中陰性對照組視野平均侵襲細胞數(shù)為190.4±10.5，CAⅨ過表達組的平均侵襲細胞數(shù)為279±14.04，比陰性對照組侵襲力上調(diào)，差異有顯著性(P<0.05)，CAⅨ干擾表達組視野平均侵襲細胞數(shù)為140±6.8，比陰性對照組侵襲力下調(diào)，差異有顯著性(P<0.05)。

圖6 CAⅨ過表達組遷移速度高于陰性對照組、CAⅨ干擾表達組

3 討論

缺氧是包括HCC在內(nèi)的惡性腫瘤發(fā)展過程中普遍存在的現(xiàn)象，缺氧環(huán)境中一部分腫瘤細胞死亡形成壞死灶，而部分腫瘤細胞內(nèi)部會發(fā)生一系列缺氧反應(yīng)以適應(yīng)和克服缺氧環(huán)境，主要包括無氧代謝增加、細胞凋亡抑制、新生血管形成、腫瘤局部浸潤及轉(zhuǎn)移能力增強等[4]。目前認為低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α在缺氧反應(yīng)的啟動和調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，在HCC中HIF-1α被認為是其治療的靶點，HIF-1α過表達與肝癌患者不良預(yù)后有關(guān)[5-6]。CAⅨ是HIF-1α的下游靶點之一，是可靠的組織缺氧標志物[3]。CAⅨ主要表達于正常組織中的胃腸道上皮、卵巢體表上皮、胰管細胞、毛囊細胞和胎睪丸中，通常定位于有高增殖能力的上皮，具有調(diào)節(jié)細胞增殖的作用[7]。研究表明，CAⅨ在人類多種惡性腫瘤中均存在過表達，包括肺癌、乳腺癌、頭頸部腫瘤、膀胱癌、子宮頸癌、胃食管癌、結(jié)直腸癌、膽囊癌及軟組織肉瘤等，并與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[8-19]。研究顯示，CAⅨ參與介導(dǎo)的細胞外酸化與缺氧微環(huán)境中腫瘤細胞的成瘤轉(zhuǎn)化、細胞外基質(zhì)降解、細胞生長因子誘導(dǎo)、蛋白酶活化密切相關(guān)，并且可通過競爭性抑制β-catenin，從而降低E-cadherin在MDCK細胞中介導(dǎo)的細胞間黏附作用[20]。在子宮頸癌細胞株C33A中，CAⅨ可激活Rho-GTPase信號通路，通過與CA9-DKK1的相互作用及β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)導(dǎo)致細胞黏附力減弱，活動力增強，從而促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[21]。

CAⅨ的表達在HCC中的研究較少。Luong-Player等[22]發(fā)現(xiàn)，CAⅨ僅在15%的HCC中表達，其表達可用于鑒別HCC和肝內(nèi)膽管癌。Yu等[23]研究顯示，CAⅨ在30.4%的HCC中表達，但CAⅨ免疫反應(yīng)的范圍和強度均與臨床指標無關(guān)。Huang等[24]研究結(jié)果顯示，CAⅨ是HCC獨立的不良預(yù)后因子。Hyuga等[25]研究發(fā)現(xiàn)CAⅨ表達與腫瘤分化無顯著相關(guān)性(117例)，多因素分析又顯示CAⅨ的表達是HCC患者復(fù)發(fā)和預(yù)后的獨立影響因素。

組織病理檢查不僅是確診HCC的金標準，其對HCC分化程度的判讀及患者治療、預(yù)后均發(fā)揮至關(guān)重要的作用，其分化程度越低代表腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力越強，患者預(yù)后越差。本實驗結(jié)果顯示，CAⅨ在35.8%的HCC中表達，但在癌旁組織中均陰性。隨著腫瘤分化程度的不同，其陽性率差異有顯著性，高分化組為10.0%(2/20)、中分化組為29.6%(8/27)、低分化組為70.0%(14/20)，以上結(jié)果表明CAⅨ表達升高并不是HCC發(fā)生的早期事件，且與HCC腫瘤的惡性發(fā)展及組織分化程度密切相關(guān)。隨訪結(jié)果顯示CAⅨ陽性和陰性患者的總生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，CAⅨ陽性患者的總生存率顯著低于CAⅨ陰性患者，與TCGA數(shù)據(jù)庫中CAⅨ miRNA表達及預(yù)后關(guān)系較為一致。CAⅨ可能成為HCC獨立的不良預(yù)后因子用于病理診斷工作中，指導(dǎo)HCC患者治療。

為進一步探討CAⅨ對HCC增殖及侵襲/轉(zhuǎn)移能力的影響，本實驗利用CAⅨ過表達載體和siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細胞HepG2，通過CCK-8實驗和細胞遷移/侵襲實驗觀察CAⅨ過表達和低表達時，其對肝癌細胞HepG2增殖和侵襲能力的影響。細胞增殖實驗數(shù)據(jù)顯示CAⅨ的表達水平與肝癌細胞HepG2的增殖能力相關(guān)，siRNA干擾沉默HepG2細胞中CAⅨ的表達會抑制其增殖生長；細胞遷移/侵襲實驗數(shù)據(jù)顯示CAⅨ的過表達能促進肝癌細胞HepG2的侵襲轉(zhuǎn)移能力，且與陰性對照組細胞相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。推測隨著HCC分化程度的降低，CAⅨ表達升高進一步促進腫瘤細胞的增殖、遷徙/轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，CAⅨ蛋白表達上調(diào)與HCC病理分化程度相關(guān)，其陽性率與腫瘤分化程度呈負相關(guān)，且CAⅨ高表達患者總生存率顯著降低。細胞實驗也顯示，CAⅨ過表達可以顯著促進肝癌細胞HepG2的增殖、遷徙/轉(zhuǎn)移能力。由于CAⅨ在包括肝組織在內(nèi)的其他正常組織中低表達或不表達，有望成為HCC臨床診斷和治療的新靶點。