王琨璐，付志豪，王宇彬，劉元昊，高澤晗，冷建寧，尚 晶，錢金澤，劉 巍

淀粉樣變性是由多種原因引起的淀粉樣蛋白錯誤的折疊聚集，進而形成不溶性纖維沉積于各組織和重要臟器之間，造成其功能損傷或衰竭的一組慢性臨床綜合征，其中包括朊病毒病(prion disease, PD)、Ⅱ型糖尿病、阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease, AD)等[1]。AA淀粉樣變性是最常見的系統(tǒng)性淀粉樣變性之一，由血清淀粉樣蛋白A沉積于肝臟等重要臟器引起，臨床上常繼發(fā)于慢性感染或炎癥，預后較差[2]。由熱休克、氧化應激等因素誘發(fā)的熱休克反應(heat shock response, HSR)和由內(nèi)質網(wǎng)功能障礙引起的未折疊蛋白質反應(unfolded protein response, UPR)是維持機體穩(wěn)態(tài)所必需的系統(tǒng)，其激活異?？赡軐е律窠?jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展。目前對于兩種應激反應系統(tǒng)在AA淀粉樣變性中的相互作用還缺乏了解，并且相關通路在該病中的作用機制和調控途徑未見詳細報道。本實驗采用熱休克轉錄因子1(heat shock transcription 1, HSF1)基因敲除小鼠構建肝臟AA淀粉樣變模型，著重探討UPR通路中的2個主要因子：活化轉錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)和X-盒結合蛋白1(X-box binding protein 1, XBP1)在肝臟AA淀粉樣變中的作用機制以及HSP1對其通路的調節(jié)，以證實HSR與UPR的相互作用，有助于該病在臨床上的預防與治療策略的合理選擇。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組HSF1基因敲除型小鼠受贈于日本山口大學醫(yī)學系研究科醫(yī)化學系中井彰教授。所用小鼠均為8周齡雄鼠，分組如下：HSF1基因敲除鼠10只，隨機分為敲除型實驗組和敲除型空白組，每組各5只。野生型小鼠12只，隨機分為野生型實驗組和野生型空白組，每組各6只。

1.2 模型制備依據(jù)Pras的經(jīng)驗方法，AA淀粉樣纖維種子由AA淀粉樣變誘導的野生型小鼠肝臟組織中提取，各實驗組采用尾靜脈注射AA淀粉樣纖維(1 μg/100 μL)，同時給予皮下注射1%AgNO30.5 mL的方法制備AA淀粉樣變模型，并每隔1天皮下注射1%AgNO30.5 mL持續(xù)誘導炎癥刺激。誘導實驗進行1周后造模完成。

1.3 組織取材淀粉樣變誘導1周后取材，采用乙醚麻醉后處死小鼠，取小鼠肝臟置入液氮，部分置于10%中性福爾馬林與4%多聚甲醛配置成的固定液中室溫固定進行形態(tài)學實驗。其余部分直接冷藏于-80 ℃進行分子生物學實驗。

1.4 形態(tài)學實驗將10%中性福爾馬林固定后的肝臟組織包埋封蠟，待蠟塊成型后，參考李敏等[3]對肝臟組織進行石蠟切片并保存于4 ℃。將肝臟切片進行剛果紅染色，并在偏光鏡下觀察染色情況，確定淀粉樣沉積程度。同時對相同部位連續(xù)切片進行免疫組化SP法染色，小鼠淀粉樣蛋白A(mouse amyloid A, mAA)抗體稀釋比例1 ∶3 000，在顯微鏡下觀察切片，特異性地判斷淀粉樣沉積情況。

1.5 分子生物學實驗(1)肝組織GRP78、ATF6及XBP1蛋白檢測：采用SDS-PAGE進行電泳分離，轉膜后檢測蛋白的表達，所用抗體的稀釋比例分別為GRP78(1 ∶3 000)、ATF6(1 ∶200)和XBP1(1 ∶200)。(2)肝組織中ATF6及XBP1 mRNA檢測：從肝臟組織中提取RNA并合成cDNA，使用Taq DNA Polymerase進行擴增。實時定量檢測采用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒，操作系統(tǒng)選用Mx 3005 RT-PCR SYSTEM。

1.6 統(tǒng)計學分析應用StatView software package(Abacus Concepts, Berkeley, CA, USA)完成數(shù)據(jù)分析，采用Mann-WhitneyU完成數(shù)據(jù)的組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HSF1敲除對肝臟AA淀粉樣變的影響將小鼠肝臟切片進行剛果紅染色，結果顯示敲除型實驗組淀粉樣物質沉積顯著高于野生型實驗組，而敲除型與野生型空白組均未見淀粉樣物質沉積(圖1、2)；并且淀粉樣物質沉積多侵及匯管區(qū)血管壁，肝實質一般不受侵犯，符合AA淀粉樣變性特點。對相同部位連續(xù)切片進行mAA免疫組化SP法染色，可見在綠色熒光位置出現(xiàn)等量的淀粉樣沉積，證明剛果紅染色所見淀粉樣物質沉積即為AA淀粉樣物質(圖3)。上述結果提示，HSF1的缺失促進肝臟AA淀粉樣變的形成。

圖1 各組小鼠肝臟組織中淀粉樣物質的沉積，剛果紅染色：A.野生型空白組；B.野生型實驗組(箭頭為淀粉樣沉積物)；C.野生型實驗組(偏正光)(箭頭為淀粉樣沉積物)；D.敲除型空白組；E.敲除型實驗組(箭頭為淀粉樣沉積物)；F.敲除型實驗組(偏正光)(箭頭為淀粉樣沉積物)

圖2 各組小鼠肝臟組織中淀粉樣蛋白指數(shù)的比較

圖3 各組小鼠肝臟組織中mAA的表達，SP法：A.野生型空白組；B.野生型實驗組(箭頭所示)；C.敲除型空白組；D.敲除型實驗組(箭頭所示)

2.2 AA淀粉樣變中HSF1的缺失對UPR作用的影響內(nèi)質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)中的關鍵蛋白GRP78的表達，標志ERS的激活與UPR的啟動。Western blot法檢測結果顯示：野生型實驗組、敲除型實驗組中GRP78蛋白表達量均高于相應的空白組，而敲除型實驗組GRP78蛋白的表達量明顯低于野生型實驗組(圖4)；提示AA淀粉樣變性激活ERS進而引發(fā)UPR，通過誘導GRP78的合成促進內(nèi)質網(wǎng)中蛋白質的折疊，對受損細胞具有保護作用，而HSF1的缺失一定程度上削弱了這種保護反應。

圖4 Western blot法檢測各組小鼠肝臟組織中GRP78的表達

2.3 ATF6與XBP1 mRNA表達水平的相關性RT-PCR結果顯示：野生型實驗組ATF6 mRNA表達量低于野生型空白組，但前者XBP1 mRNA表達量顯著高于后者；敲除型實驗組ATF6 mRNA表達量顯著高于敲除型空白組，但前者XBP1 mRNA表達量低于后者。以上結果提示，在AA淀粉樣變過程中，ATF6與XBP1的表達呈反向相關(圖5)。

圖5 各組小鼠肝臟組織中ATF6和XBP1 mRNA的表達量

本組針對ATF6因子進行Western blot檢測，結果可見敲除型實驗組ATF6蛋白的表達量顯著上升(圖6)，此結果與RT-PCR結果相吻合。再針對XBP1因子進行Western blot檢測，可見野生型實驗組XBP1蛋白表達量顯著高于野生型空白組，敲除型實驗組XBP1蛋白表達量明顯低于敲除型空白組，而野生型空白組與敲除型空白組XBP1蛋白的表達量無明顯差異，該結果亦與RT-PCR結果相吻合。此外，作為ATF6直接調控的下游因子以及經(jīng)剪切后發(fā)揮作用的XBP1s原型，XBP1u在野生型實驗組淀粉樣變的發(fā)展中表達增強，而在敲除型實驗組淀粉樣變的發(fā)展中表達減弱(圖7)。

圖6 Western blot法檢測各組小鼠肝臟組織中ATF6的表達

圖7 Western blot法檢測各組小鼠肝臟組織中XBP1的表達

3 討論

淀粉樣變性是一種以蛋白質構象障礙為特點的嚴重慢性全身性疾病，AA淀粉樣變性是最常見的系統(tǒng)性淀粉樣變性之一，其發(fā)病機制與細胞應激反應密切相關。HSF1作為調節(jié)熱休克蛋白的主要轉錄因子，能夠抑制朊病毒蛋白(prion protein, PP)、多聚谷氨酰胺(polyglutamine)蛋白等蛋白質的異常聚集和錯誤折疊，還可影響老化淀粉樣物質(AApoAII amyloid fibrils)的形成[4-6]。本實驗結果同樣證實HSF1的缺失促進肝臟AA淀粉樣變的形成，且淀粉樣變沉積多侵及匯管區(qū)血管壁，肝實質一般不受侵犯，與先前實驗結果相吻合[7]。

同時已有多種研究表明，應對ERS的保護性反應UPR與AD等淀粉樣變疾病高度相關[8]。UPR系統(tǒng)由3個緊密相連的信號通路構成，分別為PKR樣內(nèi)質網(wǎng)激酶、ATF6和肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α, IRE1α)。其中，ATF6和IRE1α的啟動子與內(nèi)質網(wǎng)中的GRP78結合，通過誘導分子伴侶和去除錯誤折疊蛋白質起保護細胞的作用：ATF6全長蛋白在轉運到高爾基體后被激活，并被加工為可溶性細胞質片段釋放，能夠進入細胞核并激活特定基因子集的轉錄。IRE1α則通過自磷酸化被激活，導致XBP1 mRNA的加工，產(chǎn)生有效的轉錄因子XBP1s發(fā)揮作用。有關ATF6與XBP1通路的緊密聯(lián)系已得到證實：當細胞處于穩(wěn)態(tài)時，ATF6以酶原形式與GRP78結合[9]；而UPR啟動后，內(nèi)質網(wǎng)上的GRP78-ATF6復合體發(fā)生解聚，ATF6經(jīng)高爾基體被轉運至細胞核中，通過調節(jié)XBP1等相關基因的轉錄從而減輕ERS、恢復細胞穩(wěn)態(tài)[10]。

本實驗結果顯示，在野生型實驗組ATF6因子表達低于野生型空白組，XBP1因子表達則高于空白組；而在敲除型組中ATF6、XBP1因子表達呈相反趨勢，這可能是由于HSF1基因對機體具有保護作用，從而抑制應激的過度表達：在AA淀粉樣變性初期，HSF1基因被激活，增強ATF6和XBP1通路相關因子的表達以對抗應激損傷；一旦應激過度對機體自身造成破壞，ATF6的表達將被HSF1反向抑制，呈XBP1表達增強而ATF6表達減弱的趨勢。在HSF1基因敲除后，ATF6的表達因不受制約而顯著增強，應激持續(xù)存在，下游XBP1的表達隨之急劇增加，進而激活下游的凋亡途徑，導致機體損傷進一步加重。另外，結合實驗結果“XBP1u在野生型實驗組中表達高于敲除型實驗組”，可以推測敲除型實驗組XBP1s表達急劇增強會反過來抑制XBP1u的表達，從而使XBP1整體表達減弱，最終呈ATF6的表達增強而XBP1表達減弱的趨勢，其結果有待后續(xù)實驗進一步驗證。

綜上所述，HSF1的缺失削弱肝臟組織中的UPR反應，從而加劇了機體淀粉樣物質的沉積程度，強有力地證實HSR和UPR之間的相關性。這與先前的實驗結論相吻合：HSR能通過多種途徑對UPR起調節(jié)作用，包括上調參與蛋白質折疊和分泌的基因、抑制總體轉錄和翻譯以及協(xié)調氧化應激等其他應激反應；并且HSR和UPR能夠共同控制ERS中的蛋白質折疊和分泌，增強內(nèi)質網(wǎng)的抗逆性[11]；同時也有實驗表明，通過HSR激活HSF1需要完整的UPR通路[12]，從而證實UPR對HSR亦存在調節(jié)作用。本實驗通過探討HSF1對ATF6-XBP1通路在肝臟AA淀粉樣變性中的作用機制，揭示了HSR與UPR在其中的相互作用，為淀粉樣變疾病的發(fā)病機制提供新依據(jù)，有助于該病在臨床上的預防與治療策略的合理選擇。