侯玥，李強(qiáng)，王岱杰，崔莉，鄭心, 3*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014；3.青島海慈醫(yī)療集團(tuán)，山東 青島 266033)

肺癌(lung cancer)又稱原發(fā)性支氣管肺癌(primary bronchial lung cancer)，是發(fā)病率最高的癌癥之一，也是近五年死亡率最高的惡性腫瘤之一[1-2]。在我國，肺癌發(fā)病率和死亡率均高居首位[3]。手術(shù)是肺癌患者首選治療方法，然而80%的患者確診時已失去手術(shù)機(jī)會，一線治療方案存在不可避免的副作用，而中醫(yī)藥可以輔助增強(qiáng)抗腫瘤療效并減輕相關(guān)毒副作用，改善患者生存質(zhì)量，因此對中醫(yī)藥抗腫瘤資源的挖掘是大勢所趨[4]。中醫(yī)認(rèn)為癌癥的病機(jī)多為正虛兼痰瘀毒互結(jié)，治療應(yīng)遵循扶正解毒、標(biāo)本兼治的原則[5-6]。基于肺癌臨床用藥數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)，黃芪和半枝蓮分別作為補(bǔ)虛藥和解毒藥，擁有高使用頻率[7-9]。研究表明，黃芪組分可以通過免疫、自噬、PI3K/Akt等多種途徑抑制肺癌增殖并誘導(dǎo)其凋亡[10-12]。半枝蓮組分通過EGFR、HIF-1α等多途徑抑制肺癌細(xì)胞系增殖[13-14]?，F(xiàn)代研究證明了黃芪和半枝蓮抑制肺癌的機(jī)制，但是結(jié)合中醫(yī)癌癥虛實(shí)夾雜的發(fā)病理論，對兩藥的協(xié)同作用以及相關(guān)通路和分子機(jī)制的研究還未見報道。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對黃芪-半枝蓮(AR-SBH)藥對進(jìn)行了系統(tǒng)分析，預(yù)測了該藥對的作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制，闡明了該藥治療肺癌的理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究提供依據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 黃芪-半枝蓮化學(xué)成分收集以及相應(yīng)靶點(diǎn)預(yù)測

應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine System Pharmacology and Analysis Platform，TCMSP)[15]收集黃芪-半枝蓮有效成分。根據(jù) Lipinski的5個規(guī)則，即分子量<500、-2<脂水分配系數(shù)<5、氫鍵供體數(shù)(Hdon)<5、氫鍵受體數(shù)(Hacc)<10、旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)(RBN)<10[16]和ADME(absorption, distribution, metabolism, excretion)特性，設(shè)置類藥性(DL)≥0.18和口服生物利用度(OB)≥40%[17]篩選出活性較高的化合物。進(jìn)一步收集TCMSP 數(shù)據(jù)庫和比較毒物基本組學(xué)數(shù)據(jù)庫(Comparative Toxicogenomics Database，CTD)[18]數(shù)據(jù)庫中收錄的黃芪-半枝蓮化合物靶點(diǎn)并使用Uniprot數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化為基因名(gene name)，剔除無效、重復(fù)靶點(diǎn)，用軟件Cytoscape 3.7.1繪制黃芪-半枝蓮藥對的藥物-化合物-靶點(diǎn)圖。

1.2 肺癌相關(guān)疾病靶點(diǎn)收集

與原發(fā)性支氣管肺癌相關(guān)的基因來源于人類基因綜合數(shù)據(jù)庫(GeneCard)[19]，可以檢索與人類疾病相關(guān)的基因。輸入“l(fā)ung cancer”和“primary bronchial lung cancer”，得到數(shù)據(jù)庫收錄的肺癌相關(guān)靶基因。

1.3 靶點(diǎn)映射和目標(biāo)靶點(diǎn) PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將化合物靶點(diǎn)和疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，取化合物和疾病靶點(diǎn)的交集，繪制Venn圖，取交集靶點(diǎn)作為目標(biāo)靶點(diǎn)進(jìn)行黃芪-半枝蓮治療肺癌的分子機(jī)制分析。用Cytoscape 3.7.1繪制化合物-靶點(diǎn)-疾病圖，用String[20]工具構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)并用Cytoscape 3.7.1展示。

1.4 MCODE聚類分析

MCODE是一種基于密度的多元蛋白質(zhì)復(fù)合物算法，與直接用平均度值和介度中心性篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)比較，MCODE可以從整體上把握靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)，是熵值較低的一種模塊劃分方法，且優(yōu)于同類型Fuzzifier、Spectral clusters of protein sequences等算法[21]。利用MCODE插件進(jìn)行聚類構(gòu)建模塊，經(jīng)過MCODE插件分析后獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)(key target)。

1.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

利用DAVID(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)進(jìn)行黃芪-半枝蓮藥對關(guān)鍵靶點(diǎn)的基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，使用R軟件以氣泡圖展示。其中，GO功能富集分析的BP為生物學(xué)過程、CC為細(xì)胞組成、MF為分子功能。使用ClueGO插件分別對黃芪治療肺癌的靶點(diǎn)和黃芪-半枝蓮藥對治療肺癌的共有靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析并繪制通路富集分析餅狀圖。

2 結(jié)果

2.1 黃芪-半枝蓮活性成分收集以及相應(yīng)靶點(diǎn)預(yù)測

數(shù)據(jù)庫共篩選出黃芪-半枝蓮活性成分16種，見表1。預(yù)測靶點(diǎn)287個，中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖見圖1。

注：藍(lán)色代表半枝蓮的主要成分；綠色代表黃芪的主要成分；紫色代表化合物的靶點(diǎn)。

表1 黃芪-半枝蓮活性成分

2.2 肺癌相關(guān)靶點(diǎn)收集以及靶點(diǎn)映射結(jié)果

在GeneCard數(shù)據(jù)庫中共找到21 901個肺癌相關(guān)靶點(diǎn)，收集關(guān)聯(lián)分?jǐn)?shù)(relevance score)大于20的靶點(diǎn)。剔除無效靶點(diǎn)共得到肺癌相關(guān)靶點(diǎn)730個，與黃芪-半枝蓮287個靶點(diǎn)進(jìn)行映射后得到111個目標(biāo)靶點(diǎn)，見圖2。由圖2可知，黃芪-半枝蓮共同作用肺癌的靶點(diǎn)，其中黃芪-半枝蓮藥對共有的靶點(diǎn)34個，黃芪單獨(dú)作用于76個靶點(diǎn)，與中醫(yī)治療肺癌重視補(bǔ)虛、攻補(bǔ)兼施相一致。

圖2 黃芪-半枝蓮活性成分靶點(diǎn)與肺癌相關(guān)靶點(diǎn)交集

化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖顯示圖中有128個節(jié)點(diǎn)和421條邊，見圖3。圖中節(jié)點(diǎn)越大，則度值(degree)越高，其中山奈酚的度值最高為87。度值較高的目標(biāo)靶點(diǎn)有：前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(GSK-3β)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGFA)、腫瘤壞死因子(TNF)等。

注：黃色代表疾病；紅色代表化合物；紫色代表靶點(diǎn)；節(jié)點(diǎn)越大代表度值越大，說明作用于此靶點(diǎn)的化合物越多。

2.3 目標(biāo)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)和聚類分析

進(jìn)入String工具，輸入目標(biāo)靶點(diǎn)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4(a),可知目標(biāo)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)共111個節(jié)點(diǎn)。利用Cytoscape 3.7.1插件MCODE對PPI網(wǎng)絡(luò)圖中111個目標(biāo)靶點(diǎn)進(jìn)行聚類分析，得到55個關(guān)鍵靶點(diǎn)即圖4(a)中的黃色靶點(diǎn)，其PPI網(wǎng)絡(luò)圖見圖4(b)。其中，節(jié)點(diǎn)越大顏色越藍(lán)代表節(jié)點(diǎn)度值越大，節(jié)點(diǎn)越小顏色越黃代表節(jié)點(diǎn)度值越小，綠色節(jié)點(diǎn)是中間度值的節(jié)點(diǎn)。其中評分(MCODE Score)較高的10位分別是腫瘤蛋白53(TP53)、胱天蛋白酶-3(CASP3)、血管內(nèi)皮生長因子-α(VEGFA)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、白蛋白(ALB)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、促分裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、腫瘤壞死因子(TNF)、促分裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)。

(a)目標(biāo)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò) (b)關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO與KEGG 富集分析

將2.3節(jié)篩選出的55個關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入DAVID在線數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行關(guān)鍵靶點(diǎn)GO功能富集和KEGG通路富集分析，根據(jù)P值將結(jié)果排名前10的條目進(jìn)行展示見圖5。本研究發(fā)現(xiàn)黃芪-半枝蓮生物功能主要富集在RNA轉(zhuǎn)錄和炎癥，生物過程主要富集在轉(zhuǎn)錄過程，細(xì)胞組成主要富集在胞外和胞核中。主要富集的信號通路有Toll樣受體(TLR)、NOD樣受體(NLR)、低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FoxO)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶-B(PI3K-Akt)等。

注：節(jié)點(diǎn)顏色與P值有關(guān)，顏色越紅，可信度越高，即-lg P值越大；節(jié)點(diǎn)大小與富集靶點(diǎn)的數(shù)量有關(guān)，節(jié)點(diǎn)越大，富集靶點(diǎn)的數(shù)量(Gene Counts)越多。

ClueGO插件分別對黃芪-半枝蓮共有的34個靶點(diǎn)(圖6)和黃芪的110個靶點(diǎn)(圖7)，進(jìn)行KEGG通路富集分析，將相關(guān)的信號通路用一個有概括性的典型信號通路表示，用以描述黃芪-半枝蓮靶點(diǎn)富集后偏重的信號通路類型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪和半枝蓮共有的靶點(diǎn)通路都與IL-17相關(guān)的炎癥信號通路關(guān)系最為密切，其次是癌癥相關(guān)通路。而黃芪的靶點(diǎn)通路除了與炎癥關(guān)系密切還與免疫有關(guān)的人T細(xì)胞白血病病毒感染(human T-cell leukemia virus 1 infection)相關(guān)性大，其次是癌癥相關(guān)通路。

圖6 黃芪-半枝蓮共有靶點(diǎn)的通路富集分析餅狀圖

圖7 黃芪靶點(diǎn)的通路富集分析餅狀圖

3 討論

中醫(yī)學(xué)將肺癌歸于“肺積”“息賁”“積聚”等，認(rèn)為肺癌是本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜之證。《外證醫(yī)案》云“正氣虛則成巖”。紀(jì)立秋[22]認(rèn)為腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵是“內(nèi)虛”?！秲?nèi)經(jīng)·靈樞》云“虛邪之人……久留而內(nèi)著，邪氣居其間而不反，發(fā)為瘤”，說明邪毒聚集不散是癌癥發(fā)病的重要機(jī)制。因此，治療肺癌應(yīng)遵循扶正解毒的原則。黃芪是最常用的補(bǔ)虛藥之一，又入肺經(jīng)，《藥性歌訣》云“黃芪入藥，為強(qiáng)壯劑，具有益正氣，壯脾胃，排膿止痛，活血醫(yī)危的功效”。而半枝蓮有清熱解毒、活血祛瘀、消腫止痛、抗癌等功能[23],因此，黃芪-半枝蓮藥對在治療肺癌方面有充足的中醫(yī)理論基礎(chǔ)。

3.1 化合物及靶點(diǎn)分析

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示，黃芪的主要成分山奈酚通過MAPK/ERK途徑影響MAPK、ERK、p38和JNK的磷酸化，實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[24]；通過抑制IL-4和COC-2的表達(dá)，下調(diào)NF-κB相關(guān)的炎癥反應(yīng)[25]；還通過VEGF、HIF-1和依賴于CASP3凋亡通路等靶點(diǎn)從血管生成、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等途徑發(fā)揮抗癌活性[26-28]。MAPK、IL-4、VEGF、CASP3是本研究預(yù)測的山奈酚靶點(diǎn)，其中CASP3、VEGFA、MAPK是MCODE篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)，在治療肺癌中有重要作用。MAPK、HIF-1信號通路在KEGG富集分析中分別位于第9位和第4位，說明了本研究的可靠性。黃芪另一成分刺芒柄花素通過STAT(信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白)、PI3K/AKT和有絲分裂原激活的MAPK[29]等3條信號通路通過細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)因子抑制細(xì)胞增殖，此外，黃芪活性成分毛蕊異黃酮可以下調(diào)CCNA2、CDK2、CCNB1 等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，通過阻滯細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖[30]。綜上所述，黃芪主要成分可以通過VEGF、MAPK/ERK、HIF-1、PI3K/AKT等途徑抑制腫瘤細(xì)胞的惡性行為。

本研究顯示半枝蓮活性成分中靶點(diǎn)最多的是圣草酚，度值為21。現(xiàn)代藥理研究顯示圣草酚有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用；在炎癥方面，可能通過MAPKs信號傳導(dǎo)通路以及IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥相關(guān)靶點(diǎn)，通過AKT/FoxO1信號通路抑制炎癥反應(yīng)[31]。TNF、FoxO1和AKT信號通路在本研究的KEGG富集分析中分別位于第1位、第5位和第9位。

在上述靶點(diǎn)中，MAPK3存在于全部排名前十的信號通路中，AKT1在排名前十的信號通路中富集了9個，TNF富集了6個。這3個靶點(diǎn)都是治療癌癥的重要靶點(diǎn)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色。因此，黃芪-半枝蓮藥對從血管生成、信號傳導(dǎo)、抗炎、抗氧化等多靶點(diǎn)、多途徑抑制了腫瘤細(xì)胞的惡性行為。

3.2 通路分析

本研究KEGG富集分析顯示黃芪-半枝蓮富集的信號通路主要有TLR、NLR、HIF-1、FoxO、PI3K-Akt等信號通路，這些信號通路已經(jīng)被證實(shí)與肺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。其中TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9促使分泌多種炎性因子，通過發(fā)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[32]。NLR家族與包括肺癌在內(nèi)的19余種癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[33]。缺氧可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性行為的潛能，HIF-1α高表達(dá)可激活腫瘤細(xì)胞的代謝、血管擴(kuò)張、血管形成，使腫瘤易于侵襲、轉(zhuǎn)移[34]。轉(zhuǎn)錄因子FoxO1通過磷酸化、乙?；日{(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，調(diào)控NSCLC細(xì)胞的凋亡、周期、DNA損傷修復(fù)等生物學(xué)過程來抑制NSCLC細(xì)胞生長[35]。PI3K-AKT通路在 NSCLC 的發(fā)生發(fā)展中具有雙重作用，一方面通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展，另一方面通過參與免疫抑制微環(huán)境的形成介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[36]。因此，本研究預(yù)測黃芪-半枝蓮藥對通過多靶點(diǎn)抑制以上通路的表達(dá)抑制肺癌的發(fā)生發(fā)展。

此外，分別分析黃芪和半枝蓮的靶點(diǎn)相關(guān)通路(圖6、圖7)，發(fā)現(xiàn)兩者共有靶點(diǎn)主要與抗炎相關(guān)信號通路如TNF、MAPK、TLR和NLR信號通路相關(guān)。黃芪的靶點(diǎn)不僅與上述抗炎信號通路相關(guān)，還與免疫相關(guān)的信號通路有關(guān)，預(yù)測黃芪可提高免疫力的結(jié)論與中藥黃芪“補(bǔ)虛”這一理論相一致。因此，黃芪在抗炎和提高人體免疫力及抗腫瘤方面均有作用，與半枝蓮合用更加強(qiáng)了抗炎和抗腫瘤效果。

4 結(jié)論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對黃芪-半枝蓮藥對活性成分及其治療肺癌的機(jī)制進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)黃芪-半枝蓮藥對的主要化合物成分如山奈酚、圣草酚、毛蕊異黃酮等有眾多靶點(diǎn)，如TP53、VEGFA、AKT1、MAPK、TNF、IL-6等，可能通過TNF、HIF-1、FoxO、TLR和NLR等通路在炎癥、血管生成等過程共同起到治療肺癌的作用。通過對黃芪和半枝蓮的靶點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)黃芪從抗炎、抗腫瘤和免疫等方面抑制肺癌細(xì)胞惡性行為；黃芪與半枝蓮合用加強(qiáng)了抗炎和抗腫瘤的作用，為黃芪-半枝蓮治療肺癌的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供了理論基礎(chǔ)。