陳燕妮 王蘭蘭 查青 史海龍 馮雪松 晁旭

中醫(yī)藥在治療腫瘤方面有著上千年的經(jīng)驗(yàn)積累，中醫(yī)學(xué)者在腫瘤免疫和重塑腫瘤微環(huán)境以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬[1]等多個(gè)方面研究中藥單味藥、復(fù)方藥對(duì)腫瘤的治療作用。實(shí)驗(yàn)組前期研究表明，貝參茱萸方含藥血清對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，其抑制作用與含藥血清的濃度具有相關(guān)性，貝參茱萸方含藥血清能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，將細(xì)胞周期阻滯于G1期[2]。本實(shí)驗(yàn)通過貝參茱萸方對(duì)H22肝癌荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用和機(jī)制進(jìn)行研究，進(jìn)一步評(píng)價(jià)中醫(yī)藥治療腫瘤的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)40只雄性昆明小鼠，周齡為6～8周，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)：SCXK(京)2016-001。

1.2 藥物與試劑

貝參茱萸方處方：土貝母20 g、西洋參15 g、絞股藍(lán)10 g、山茱萸10 g、生甘草5 g。購(gòu)自陜西中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院。將60 g中藥材先加1000 mL的超純水浸泡2小時(shí)，然后加熱煎煮1小時(shí)倒出藥液，再次加入1000 mL的超純水煎煮1小時(shí)，分離藥渣，保留所煎出的藥液。將第1次和第2次藥液混勻，繼續(xù)熬制藥物將藥物調(diào)制為1 g·mL-1、0.5 g·mL-1、0.25 g·mL-1三個(gè)不同濃度于-4℃冰箱儲(chǔ)存；H22細(xì)胞(編號(hào)：ZQ0109)購(gòu)自上海茂科生物科技有限公司。

1.3 瘤細(xì)胞懸液的制備

將凍存H22細(xì)胞復(fù)蘇，傳代2次后，用PBS溶液將細(xì)胞調(diào)制成1×107個(gè)/mL的細(xì)胞混懸液。然后將0.1 mL瘤細(xì)胞混懸液接種在2只昆明小鼠的腹腔內(nèi)，7天后，小鼠腹腔內(nèi)長(zhǎng)滿瘤性腹水。用1 mL無(wú)菌針管抽取小鼠的腹水，1000 rpm 離心5分鐘，然后用生理鹽水調(diào)制成1×107個(gè)/mL瘤細(xì)胞混懸液，備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

40只昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，于造模前12小時(shí)禁食不禁水，造模當(dāng)天用隨機(jī)分組法將40只小鼠分為5組，分別為空白組、模型組、貝參茱萸方高濃度組、貝參茱萸方中濃度組、貝參茱萸方低濃度組，每組8只，分組完成后給除空白組外的所有小鼠的右前肢皮下接種制備好的細(xì)胞混懸液0.1 mL，接種好后每組小鼠尾巴用記號(hào)筆標(biāo)號(hào)，在空白組小鼠右前肢皮下注射0.1 mL生理鹽水，用記號(hào)筆尾巴標(biāo)號(hào)。造模后第二天用不同濃度藥物進(jìn)行小鼠灌胃，貝參茱萸方高濃度組灌胃藥液濃度為1 g·mL-1、貝參茱萸方中濃度組藥液灌胃濃度為0.5 g·mL-1、貝參茱萸方低濃度組藥液灌胃濃度為0.25 g·mL-1，灌胃周期為30天?？瞻捉M與模型組用生理鹽水灌胃治療，所有小鼠的灌胃劑量為0.4 mL/只，每日一次。

1.5 動(dòng)物一般情況觀察

觀察小鼠的飲食、睡眠、活動(dòng)、皮毛顏色等，測(cè)量小鼠的體重、飲食、腫瘤大小變化，觀察小鼠的死亡只數(shù)并記錄死亡時(shí)間。待小鼠成瘤后每隔3日對(duì)小鼠體重、飲食量進(jìn)行測(cè)量并用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠腫瘤的長(zhǎng)短直徑分別記為a、b，用以下公式計(jì)算腫瘤體積：腫瘤體積=a×b2/2；

1.6 標(biāo)本采集

末次灌胃2小時(shí)后用頸椎脫臼法快速處死各組小鼠，用玻璃分針小心剝離小鼠瘤組織，將每只小鼠的瘤組織用生理鹽水沖洗兩遍，1/2瘤裝入凍存管放-80℃冰箱儲(chǔ)存，其余1/2瘤組織用4%的多聚甲醛固定。

1.7 檢測(cè)指標(biāo)

HE染色法分析腫瘤組織病理情況；免疫組化法分析Ki67在各組H22肝癌荷瘤小鼠內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞率將包埋切片的片子按照二步法免疫組化試劑盒(DAKO，K5007)說明進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)組至少選取3張不同的片子進(jìn)行拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件分析得出總細(xì)胞數(shù)量和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量得出陽(yáng)性細(xì)胞率(%)=(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100)；Western blot法檢測(cè)腫瘤組織中caspase-3、caspase-9的蛋白表達(dá)情況：液氮研磨肝癌組織，提取蛋白，蛋白定量后上樣轉(zhuǎn)膜，一抗孵育過夜，洗凈一抗(Servicebio，GB11026)，加入二抗(Servicebio，GB23303)，2小時(shí)后暗室曝光并掃描膠片分析灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)

各組小鼠在30天的治療過程中，模型組及貝參茱萸方高濃度組各有1只小鼠在未長(zhǎng)出腫瘤前死亡，死亡原因可能為灌胃操作不當(dāng)。成瘤后小鼠死亡情況：模型組小鼠死亡兩只、貝參茱萸方中濃度組死亡2只、貝參茱萸方低濃度組死亡1只、空白組和貝參茱萸方中濃度組無(wú)小鼠死亡。帶瘤小鼠隨瘤體逐漸長(zhǎng)大出現(xiàn)了行動(dòng)受限、后期出現(xiàn)跛行、皮毛顏色暗淡無(wú)光澤、脫毛、消瘦、精神狀態(tài)差，腫瘤處出現(xiàn)破潰；用藥組小鼠也出現(xiàn)了行動(dòng)受限、但精神狀態(tài)比模型組佳，其中貝參茱萸方中濃度組的小鼠行動(dòng)與精神狀態(tài)最好，皮毛顏色光亮，用藥組小鼠腫瘤均未破潰。

2.2 各組小鼠體重變化

各組小鼠的體重均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)；空白組小鼠的體重變化幅度小，模型組和貝參茱萸方高濃度組的小鼠體重增長(zhǎng)幅度最大。結(jié)果見圖1。

圖1 貝參茱萸方抑制H22肝癌荷瘤小鼠腫瘤實(shí)驗(yàn) 各組小鼠平均體重變化圖

2.3 各組小鼠腫瘤體積變化

于造模后第8天開始對(duì)腫瘤大小進(jìn)行測(cè)量：(1)空白組小鼠未成瘤，未納入統(tǒng)計(jì)；(2)各組腫瘤體積大體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)；(3)在8～20天時(shí)，模型組與給藥組腫瘤體積大小區(qū)別不大；(4)第28天 時(shí)：貝參茱萸方中濃度(0.5g·ml-1)腫瘤體積最小，模型組腫瘤體積最大；與模型組相比，貝參茱萸高、中濃度組小鼠腫瘤體積在第28天時(shí)明顯減小，且結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖2。

2.4 腫瘤組織HE染色結(jié)果

(1)空白組小鼠皮下無(wú)腫瘤細(xì)胞，模型組小鼠腫瘤組織中癌細(xì)胞排列緊密，未見細(xì)胞的大片壞死區(qū)域和細(xì)胞凋亡；(2)與模型組比較，給藥組的腫瘤細(xì)胞密度均有減小，且各組細(xì)胞形態(tài)有不同程度的壞死和凋亡區(qū)域，其中貝參茱萸方低濃度組的細(xì)胞形態(tài)改變最為明顯，貝參茱萸方中濃度組的細(xì)胞密度最小。結(jié)果見圖3。

注：與模型組相比，aP<0.05。

注：A：空白組；B：模型組；C：貝參茱萸方高濃度組；D：貝參茱萸方中濃度組；E：貝參茱萸方低濃度組。

2.5 各組腫瘤組織中Ki67免疫組化結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠體內(nèi)Ki67的陽(yáng)性表達(dá)明顯(P<0.05)。與模型組相比，貝參茱萸方高濃度組和中濃度組降低(P<0.05)，結(jié)果見圖4、表1。

注：A：空白組；B：模型組；C：貝參茱萸方高濃度組；D：貝參茱萸方中濃度組；E：貝參茱萸方低濃度組。

表1 貝參茱萸方對(duì)H22荷瘤小鼠皮下瘤組織中 Ki67表達(dá)的陽(yáng)性率比較

2.6 各組小鼠腫瘤組織中caspase-3和caspase-9的表達(dá)

與空白組比，caspase-3、caspase-9在模型組中的表達(dá)降低(P<0.05)。與模型組相比，促凋亡因子caspase-3在貝參茱萸方高濃度組、中濃度組的表達(dá)升高(P<0.05)，貝參茱萸方高濃度組可以促進(jìn)促凋亡因子caspase-9蛋白水平的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)果見圖5、表2。

注：A：空白組；B：模型組；C：貝參茱萸方高濃度組；D：貝參茱萸方中濃度組；E：貝參茱萸方低濃度組。

表2 貝參茱萸方對(duì)各組小鼠腫瘤組織中 caspase-3和caspase-9的表達(dá)比較

3 討論

貝參茱萸方中土貝母為君藥、西洋參和山茱萸為臣藥、絞股藍(lán)為佐藥、使藥生甘草，全方具有滋陰補(bǔ)腎和益氣健脾功效，通過疏肝理氣、活血化瘀共湊遏制癌毒的作用[3]。該方中土貝母的皂苷類物質(zhì)是其對(duì)抗腫瘤最有效的成份，有研究者[4]用土貝母皂苷作用于轉(zhuǎn)染過綠色熒光蛋白(GFP)基因的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7作用24小時(shí)后，細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7明顯凋亡，在48小時(shí)后MDA-MB-231和MCF-7的IC50為(17.03±3.22)、(27.96±0.34) μg·mL-1；土貝母皂苷Ⅰ、Ⅲ能夠抑制腫瘤細(xì)胞K562的生長(zhǎng)并將細(xì)胞周期阻滯的S期以前[5]。土貝母皂苷聯(lián)合化療藥對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞株誘導(dǎo)24小時(shí)后，細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，土貝母皂苷對(duì)細(xì)胞Hela的抑制率與藥物濃度和誘導(dǎo)時(shí)間呈正相關(guān)[6]。西洋參中抗腫瘤的有效成分主要為人參皂苷，西洋參可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、對(duì)腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡、抑制分化等作用[7]。有研究表明山茱萸對(duì)肝癌大鼠腫瘤的抑制機(jī)制是通過上調(diào)腫瘤組織中B7-H6的表達(dá)[8]。山茱萸通過線粒體介導(dǎo)的凋亡通路對(duì)由TNF-α和D-氨基半乳糖所致的肝癌細(xì)胞具有抑制作用[9]。中藥絞股藍(lán)的抗癌機(jī)制主要從增強(qiáng)T、B細(xì)胞的增殖提高免疫、抑制相關(guān)酶的代謝活性以及干擾細(xì)胞周期方面起到對(duì)抗腫瘤的功效[10]；甘草中的甘草酸和甘草次酸是腫瘤治療中起主要作用的成分[11]，可以在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫等方面發(fā)揮抗腫瘤作用。

Caspase家族是一種直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡解體的蛋白酶系統(tǒng)[12]，內(nèi)源性凋亡途徑主要在由線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞色素C(Cytochrome C)中，當(dāng)細(xì)胞色素C當(dāng)被釋放出來后立即與胞質(zhì)中的caspase-9相聯(lián)合，并形成凋亡體，進(jìn)而啟動(dòng)caspase-3發(fā)生作用，致使細(xì)胞出現(xiàn)凋亡改變[13]。caspase-3、caspase-9的異常表達(dá)與胃癌、乳腺導(dǎo)管癌等腫瘤的惡化與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14-15]。近年來很多研究表明caspase-3、caspase-9在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮重要的作用。周進(jìn)等研究顯示[16]，在誘導(dǎo)腎癌模型小鼠的凋亡過程中，白花蛇舌草能夠明顯促進(jìn)相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-9的表達(dá)，提高抑瘤率。聶艷萍等[17]在研究吉西他濱誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，在用吉西他濱作用于HepG2細(xì)胞24小時(shí)后細(xì)胞表面的caspase-3、caspase-9的表達(dá)均增強(qiáng)。貝參茱萸方對(duì)腫瘤的抑制可能與其增強(qiáng)了腫瘤組織中caspase-3、caspase-9蛋白水平的表達(dá)水平相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)貝參茱萸方可以明顯改善小鼠的狀態(tài)，經(jīng)藥物治療后的小鼠平均每日飲食量比模型組高，皮毛顏色有光澤，脫毛現(xiàn)象少，小鼠活動(dòng)隨著腫瘤的增大有所受限，但未出現(xiàn)跛行，腫瘤小鼠均出現(xiàn)消瘦，但藥物組小鼠消瘦較模型組不顯，用藥組小鼠未出現(xiàn)腫瘤破潰，小鼠帶瘤生存狀態(tài)較好，其中貝參茱萸方中濃度組對(duì)于改善小鼠狀態(tài)以及增加小鼠飲食量的效果最為顯著。在今后臨床治療肝癌時(shí)貝參茱萸方可以配合西醫(yī)放化療增強(qiáng)治療功效，改善患者帶瘤生存質(zhì)量。