賀成虎，趙海珍陸兆新，呂鳳霞，別小妹，張 充

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

小麥（Triticum sp.）是在世界各地廣泛種植的禾本科植物，是世界上總產(chǎn)量第2的糧食作物，產(chǎn)量僅次于玉米，根據(jù)美國食品藥品監(jiān)督管理局的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2018年世界小麥產(chǎn)量達7.370億 t左右。我國是全世界最大的小麥生產(chǎn)國和消費國，據(jù)國家統(tǒng)計局?jǐn)?shù)據(jù)，2018年中國小麥產(chǎn)量達1.283 5億 t。而麥麩是小麥制粉過程中的主要副產(chǎn)物，相當(dāng)于小麥質(zhì)量的15%[1]。因此，2018年僅中國小麥麩皮的產(chǎn)量就達192.5億 kg。在傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中麥麩作為面粉加工的副產(chǎn)品，多用于牲畜飼料。然而隨著食品科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)麥麩中含有豐富的功能性物質(zhì)，如膳食纖維、植物化學(xué)物、礦物質(zhì)、維生素等，尤其是消費者更接受天然營養(yǎng)強化劑，麥麩在食品加工中具有越來越重要的開發(fā)價值[2]。

盡管越來越多的研究表明全麥和富含纖維的食物對健康有益，但大多數(shù)消費者仍然更喜歡精制白面粉，因為添加麩皮的制品在口感、質(zhì)地、外觀等方面都受到了不利影響，雖然增添了營養(yǎng)性和功能性，但對消費者并不具有很強的吸引力[3-5]。對谷物麩皮進行發(fā)酵已被證明是一種可行的預(yù)處理方法，不僅可以改善富含麩皮產(chǎn)品的感官品質(zhì)，還可以提高其營養(yǎng)和功能特性，實現(xiàn)其在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用[6]。對谷物麩皮進行發(fā)酵時主要依靠外源或內(nèi)源微生物進行，具體包括添加外源乳酸菌、酵母菌等菌體的接種發(fā)酵法和依靠內(nèi)源菌的自然發(fā)酵法和back-slopping法。C?linoiu等[7]采用酵母對小麥麩皮和燕麥麩皮進行固態(tài)發(fā)酵，可以顯著提高2 種麩皮中的酚酸含量及其抗氧化活性。Decimo等[4]對玉米麩皮進行自然發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中乳酸菌和酵母菌是優(yōu)勢菌，發(fā)酵可以促進纖維部分的降解，提高膳食纖維和阿魏酸的含量，降低植酸含量。Manini等[8]采用back-slopping法對麥麩進行酸面團樣自然發(fā)酵，連續(xù)進行13 d直至微生物群落達到穩(wěn)定（乳酸菌109CFU/g、 酵母菌107CFU/g），結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵麥麩中可溶性膳食纖維含量增加了30%，水溶性阿拉伯木聚糖和游離阿魏酸含量分別比未發(fā)酵麥麩高4 倍和10 倍，植酸被徹底降解。發(fā)酵法不僅可以改善麥麩的營養(yǎng)和功能特性，還可以提高麥麩及其制品的安全性。Moran等[9]通過back-slopping方法對小麥進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)此法可以在24 h后有效去除或降低其中的大腸菌群，從而降低食源性大腸桿菌病的風(fēng)險。Katina等[10]將植物乳桿菌和戊糖片球菌應(yīng)用于麥麩發(fā)酵面團中，抑制了枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的生長。自然發(fā)酵的谷物麩皮可獲取豐富的微生物菌種。盡管目前相關(guān)分離純化菌種的研究報道也非常多，但自然發(fā)酵麩皮中微生物多樣性還沒有得到鑒定。

高通量測序可以準(zhǔn)確識別不同食物基質(zhì)中的復(fù)雜微生物，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于許多發(fā)酵食品例如豆豉[11]、泡菜[12]、酸菜[13]和發(fā)酵香腸[14]等的微生物群落分析研究中。通過高通量測序，宏基因組學(xué)可以通過靶向檢測樣品的總DNA，并識別具有流行率的優(yōu)勢菌群。它不僅可以提供有關(guān)微生物群落結(jié)構(gòu)的信息，還可以提供基因的功能組成和分布[15]。目前宏基因組學(xué)已成功應(yīng)用于發(fā)酵食品研究，但尚鮮有關(guān)于麥麩發(fā)酵過程中微生物菌群組成和變化的報道。因此，本研究擬采用高通量測序法研究麥麩back-slopping方式自然發(fā)酵過中微生物菌群組成的變化情況，為從麥麩中獲取有益菌株及通過發(fā)酵改善麥麩品質(zhì)、提高其安全性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

麥麩樣品購于河南新鄉(xiāng)。

1.2 儀器與設(shè)備

Orion Star pH計 美國Thermo公司；PYX-DHS-50X65-隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；SWCJ-U-超凈工作臺 蘇州安泰公司；AY120電子天平 日本島津公司；GXZ-9240 MBE鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅醫(yī)療設(shè)備有限公司；ZD-88-4-雙層落地恒溫振蕩器 太倉市光明實驗分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵麥麩樣品的制備

將28 g未滅菌麥麩與72 mL無菌水混勻后在37 ℃自然發(fā)酵24 h，獲得發(fā)酵麥麩作為樣品1，從樣品1中取出一部分發(fā)酵麥麩作為接種菌劑用于新的麥麩發(fā)酵（backslopping），依次類推，連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)7 個批次，發(fā)酵條件與樣品1相同，取樣品1和發(fā)酵批次為3、5和7的麥麩，一共4 組發(fā)酵麥麩樣品，分別編號為1#、3#、5#和7#，經(jīng)保鮮袋密封包裝后放置于-70 ℃冰箱保藏。將4 組發(fā)酵麥麩樣品委托北京奧維森生物公司進行高通量測序。

1.3.2 細(xì)菌和真菌Illumina MiSeq測序

測序使用Illumina MiSeq測序平臺對細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)和真菌ITS1區(qū)序列進行測序。細(xì)菌16S rDNA V3-V4區(qū)的通用引物為338F（5’-ACTCCTACGGGAGGGAG-3’）和806R（5’-GGACTACHV GGGTWTCT-3’）；真菌引物為ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和2043R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）。測序數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、過濾、剔除嵌合體，舍棄低質(zhì)量序列等得到精準(zhǔn)分析的優(yōu)質(zhì)序列，優(yōu)質(zhì)序列用于可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）與多樣性指數(shù)計算及物種豐度分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析及圖像處理

1.4.1 α多樣性分析

α多樣性是用來分析單一樣品的復(fù)雜程度，即單一樣品中的群落多樣性程度。根據(jù)OTU聚類分析的結(jié)果，采用Qiime（v 1.8）在OTU相似水平97%的條件下評估α多樣性指數(shù)，包括OTU數(shù)量、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和覆蓋率。其中Shannon指數(shù)描述樣品中微生物的多樣性，Chao1指數(shù)描述菌群的豐度，這兩個參數(shù)值越大，說明樣品復(fù)雜程度越高。覆蓋率是反映測序深度的指數(shù)之一，數(shù)值越高說明樣本中序列被測出的概率越高。

1.4.2 群落組成分析

利用RDP Classifier算法對獲得的OTU代表序列進行物種分類注釋，并與Silva數(shù)據(jù)庫進行比對，選取不同的分類水平進行群落組成的統(tǒng)計分析，根據(jù)分析結(jié)果，通過Graphpad prism 7.0、Mev 4.90和JMP trial 14.0軟件繪制樣品優(yōu)質(zhì)序列分布圖、稀釋性曲線、菌群分布柱狀圖、熱圖、主成分分析（principal component analysis，PCA）圖等可視化方法研究樣品中微生物群落組成及關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵麥麩樣品的測序結(jié)果質(zhì)量分析

采用高通量測序獲得發(fā)酵麥麩樣品的原始序列數(shù)據(jù)后，經(jīng)過Trimmomatic、FLASH等軟件優(yōu)化數(shù)據(jù)后得到了4 個樣品共97 666 條細(xì)菌有效序列，真菌有效序列為143 845 條。經(jīng)數(shù)據(jù)預(yù)處理最終得到的細(xì)菌優(yōu)質(zhì)序列分布統(tǒng)計見圖1A，測序長度主要集中在400～440 bp的區(qū)間長度內(nèi)，與設(shè)計引物擴增長度相似；真菌優(yōu)質(zhì)序列分布統(tǒng)計見圖1B，測序長度主要集中在240～320 bp的區(qū)間長度內(nèi)，與設(shè)計引物擴增序列長度為300 bp左右接近，總體測序結(jié)果說明本次測序結(jié)果較合理。

圖1 高通量測序中細(xì)菌（A）和真菌（B）的優(yōu)質(zhì)序列分布Fig. 1 High quality sequence distribution of bacteria (A) and fungi (B) in high-through sequencing

2.2 α多樣性分析

2.2.1 稀釋曲線

圖2 高通量測序中細(xì)菌（A）和真菌（B）的稀釋性曲線Fig. 2 Rarefaction curves of bacteria (A) and fungi (B) in high-through sequencing

稀釋曲線反映測序深度情況，客觀地判斷測序數(shù)據(jù)量是否合理，并間接反映樣品中物種的豐富程度。當(dāng)曲線趨于平緩時表明測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種。如果曲線趨于平坦則表明測序已趨于飽和，更多的測序數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明不飽和，繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生更多新的OTU。根據(jù)圖2可知，各發(fā)酵麥麩樣品的稀釋曲線隨測序深度的增加呈現(xiàn)先直線上升后緩慢上升直至曲線趨向平坦，說明在樣品進行測序過程中所選的測序數(shù)據(jù)量已經(jīng)足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物菌群信息，再增加測序深度也無法找到更多的OTU，發(fā)酵麥麩樣品的菌群多樣性也不會發(fā)生改變。

2.2.2α多樣性指數(shù)分析

4 組發(fā)酵麥麩樣品中，細(xì)菌有效序列的最小數(shù)量為18 060 條，真菌有效序列的最小數(shù)量為29 144 條（表1、2）。為了方便分析，所有細(xì)菌序列標(biāo)準(zhǔn)化為15 781 條，真菌序列標(biāo)準(zhǔn)化為28 759 條。OTU是系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中一個假定分類單元，通過歸類操作，將序列相似性大于等于97%的歸為一個OTU，每個OTU對應(yīng)于一個不同的微生物種，OTU數(shù)量可以代表樣品物種的豐富度。對樣品進行細(xì)菌OTU聚類分析，共產(chǎn)生262 個OTU；而真菌共產(chǎn)生291 個OTU。

表1 4 組發(fā)酵麥麩樣品細(xì)菌菌群多樣性指數(shù)比較分析Table 1 Comparative analysis of the bacterial diversity indexes of four groups of fermented wheat bran samples

表2 4 組發(fā)酵麥麩樣品真菌菌群多樣性指數(shù)比較分析Table 2 Comparative analysis of the fungal diversity indexes of four groups of fermented wheat bran samples

由表1可知，在4 個樣品中，細(xì)菌OTU數(shù)量最多可達到178，最少為153。且隨著發(fā)酵批次的增加，細(xì)菌OTU數(shù)量先增加后降低再增加，但整體是增加的趨勢，這表明麥麩發(fā)酵樣品隨發(fā)酵批次的增加豐富度逐漸增加且不同發(fā)酵批次的菌群豐富度差異較大，其中7#樣品的豐富度最高。由表2可知，真菌的OTU數(shù)量最多可達到146（3#），最少為118（1#），5#和7#的OTU數(shù)量相當(dāng)，但均低于3#，說明發(fā)酵麥麩樣品中不同批次間的菌群豐富度差異較大，但比發(fā)酵初期的豐富度均有增加。

Chao1指數(shù)值越大說明樣品中微生物群落的豐度越高，根據(jù)表1結(jié)果，隨著發(fā)酵批次增加，Chao1指數(shù)先增后減，再增加，說明隨著發(fā)酵進行，麥麩樣品中細(xì)菌群落豐度變化較大。Shannon指數(shù)先增高后降低再增高，說明隨著發(fā)酵的進行麥麩中細(xì)菌群落多樣性發(fā)生了比較明顯的改變。4 個樣品的覆蓋率均不低于99.7%，說明樣品中的序列基本完全被測出，測序結(jié)果代表了樣品中微生物的真實情況。

如表2所示，真菌的Chao1指數(shù)隨發(fā)酵批次增加，表現(xiàn)出先增后減的趨勢；而Shannon指數(shù)從發(fā)酵第1天1#樣品的2.768降低到5#樣品的最小值2.173；隨后7#樣品的Shannon指數(shù)達到最大值4.280，說明5#樣品真菌群落組成最為簡單，而7#樣品中的真菌群落組成最為復(fù)雜。4 個發(fā)酵樣品中真菌的Shannon指數(shù)整體高于細(xì)菌，說明麥麩發(fā)酵過程中真菌的多樣性遠(yuǎn)高于細(xì)菌，而Chao1指數(shù)遠(yuǎn)低于細(xì)菌，說明發(fā)酵麥麩中真菌豐度遠(yuǎn)低于細(xì)菌。覆蓋率均為99.9%，表明測序數(shù)據(jù)能夠覆蓋目前狀態(tài)下樣品中的真菌種類，能真實反映樣本中的菌群落情況，可用于后續(xù)分析。

2.3 物種組成分析

2.3.1 基于門水平的發(fā)酵麥麩菌群結(jié)構(gòu)分析

圖3 發(fā)酵麥麩中細(xì)菌（A）和真菌（B）門水平的群落分類學(xué)組成和相對豐度分布Fig. 3 Phylum-level composition and abundance distribution of bacterial (A) and fungal (B) communities in fermented wheat bran

根據(jù)得到的每個OTU在不同分類水平的物中分類信息，分析樣本OTU在不同分類水平上的群落結(jié)果。如圖3A所示，在門分類水平上，4 個麥麩發(fā)酵樣品共檢測到4 個細(xì)菌門類，分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、Streptophyta以及其他未分類的門。Firmicutes是麥麩發(fā)酵整個過程中的絕對優(yōu)勢菌門，發(fā)酵起始時其平均相對豐度為13%，發(fā)酵第7批次后達到90%，隨發(fā)酵過程進行，相對豐度先升高后趨于穩(wěn)定。Proteobacteria在發(fā)酵起始時占較高比例（86%），隨發(fā)酵進行其相對豐度逐漸降低。其他菌門相對豐度很低，但是在發(fā)酵過程中一直存在。如圖3B所示，在門分類水平上，4 組發(fā)酵樣品共檢測到4 個真菌門，分別為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、球囊菌門（Glomeroamycot）和Streptophyta以及無法歸類的真菌。Ascomycota在4 組發(fā)酵麥麩中的相對豐度分別為93.38%、83.82%、90.81%和79.67%，在整個發(fā)酵過程中一直處于絕對優(yōu)勢地位。

2.3.2 基于屬水平的發(fā)酵麥麩菌群結(jié)構(gòu)分析

圖4 發(fā)酵麥麩中細(xì)菌（A）和真菌（B）屬水平的群落分類學(xué)組成和相對豐度分布Fig. 4 Genus-level composition and relative abundance distribution of bacterial (A) and fungal (B) communities in fermented wheat bran

在屬分類水平上，以相對豐度≥1%為閾值，4 個樣本共檢測到10 個細(xì)菌屬和13 個真菌屬，將相對豐度低于1%的合并為一類（others）。從圖4A可以看出，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和片球菌屬（Pediococcus）是麥麩發(fā)酵過程中的絕對優(yōu)勢菌屬。在1#、3#、5#、7#樣品中，Lactobacillus和Pediococcus二者相對豐度分別為1.5%、29.74%、60.58%、50.36%和0.9%、60.45%、29.04%、39.62%，相對豐度隨發(fā)酵批次增加先升高后趨于穩(wěn)定。其他菌屬如假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）和梭菌屬（Clostridium）等只在發(fā)酵前期大量存在，發(fā)酵后期所占比例降低。從圖4B可知，麥麩自然發(fā)酵過程中在屬水平上主要有曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、鏈格孢屬（Alternaria）和鐮刀霉屬（Fusarium）。在麥麩發(fā)酵過程中，真菌優(yōu)勢菌群變化較大，1#樣品中以Aspergillus為主，其次為Alternaria；發(fā)酵后期以Alternaria為主，同時Aspergillus和Penicillium相對豐度下降。

2.4 相似性聚類分析

圖5 發(fā)酵麥麩樣品的細(xì)菌（A）和真菌（B）屬水平的分布熱圖Fig. 5 Heatmaps of genus-level distribution bacterial (A) and fungal (B) communities in fermented wheat bran

在屬分類水平下，將細(xì)菌和真菌的群落組成按照其在4 組樣品中的最大相對豐度排序，并取出排在最前的20 個屬繪制物種豐度聚類熱圖。從圖5可以看出，3#、5#和7#樣品的細(xì)菌菌群豐度最為接近，主要是以Lactobacillus和Pediococcus為主，而1#樣品的細(xì)菌菌群豐度與其他樣品有明顯不同，主要是以大腸桿菌屬（Enterobacter）、泛菌屬（Pantoea）和克羅諾菌屬（Cronobacter）等為主。而對于真菌菌群分布來說，整個發(fā)酵過程主要以Aspergillus和Alternaria為主，其他真菌如Penicillium、Fusarium等一直存在于在整個發(fā)酵過程中，但是相對豐度很低。熱圖分析表明，不同發(fā)酵批次的麥麩樣品中細(xì)菌和真菌菌群豐度明顯不同，這說明發(fā)酵批次對菌群豐度影響很大。

2.5 細(xì)菌和真菌群落的PCA

圖6 發(fā)酵麥麩樣品的細(xì)菌（A）和真菌（B）PCAFig. 6 PCA of bacteria (A) and fungi (B) in fermented wheat bran samples

對各組樣品中細(xì)菌和真菌的主要差異OTU（相對豐度＞1%）進行PCA，分析不同樣品中細(xì)菌和真菌的主要差異OTU與PC的關(guān)系。圖6表示不同樣品和主要差異OTU的雙標(biāo)圖，即不同樣品與其主要差異菌屬之間的關(guān)系?？梢钥闯觯l(fā)酵批次的不同對麥麩細(xì)菌和真菌菌群組成有一定的影響，細(xì)菌PC1和PC2對樣本差異性的貢獻分別達到了92.3%和7.7%，共計99.98%，真菌PC1和PC2對樣本差異性的貢獻分別達到了62%和25.9%，共計87.9%，可以代表絕大部分變量信息。在PCA中，各個點之間的距離越大，表明它們之間的菌群差異越大。在細(xì)菌和真菌的PCA中，1#樣品點與聚集在一起的3#、5#和7#樣品點之間的距離很遠(yuǎn)，這說明1#樣品與3#、5#和7#樣品的菌群組成差異較大，3#、5#和7#樣品的的菌群組成相似。對于細(xì)菌PCA，1#樣品點分布在PC1的正半軸，3#、5#和7#樣品點分布在PC1的負(fù)半軸；Cronobacter、Pantoea、Clostridium、Enterobacter和Escherichia分布在PC1的正半軸，Pediococcus和Lactobacillus分布在PC1的負(fù)半軸；這說明1#樣品的菌群變化主要是Cronobacter、Pantoea和Clostridium等菌屬存在，3#、5#和7#樣品的菌群變化主要是Pediococcus和Lactobacillus存在。同時Pediococcus和Lactobacillus之間呈正相關(guān)，與其他菌屬如Cronobacter、Pantoea和Clostridium等呈負(fù)相關(guān)。

對于真菌PCA，1#和5#樣品對PC1軸的貢獻較大，分布在PC1軸的負(fù)半軸和正半軸；Aspergilus和Penicillium與Alternaria、附球菌屬（Epicoccum）、鎖擲酵母屬（Sporidiobolus）等菌屬呈負(fù)相關(guān)，并且分布在PC1軸的負(fù)半軸和正半軸，說明這些菌屬對于1#和5#樣品的菌群變化影響最大。3#樣品對PC2軸的貢獻較大，分布在PC2軸的上側(cè)，而散囊菌屬（Eurotium）也位于PC2軸的上側(cè)，這說明除上述菌屬外，Eurotium也是造成3#樣品與其他批次樣品的菌群不同的重要因素。而7#樣品對PC1、PC2的貢獻相差不大，這說明上述菌屬都是能夠顯著影響樣品菌群變化的因素。

3 討 論

發(fā)酵麥麩中的菌群組成非常復(fù)雜，其種類多、數(shù)量大、范圍廣。目前，有關(guān)針對麥麩發(fā)酵過程中的菌群變化的研究較少，本研究通過高通量測序方法分析了麥麩發(fā)酵過程中的細(xì)菌和真菌的多樣性變化情況。在細(xì)菌方面，4 組樣品共獲得262 個OTU，多樣性指數(shù)最大的樣品為1#，最小的樣品為5#，發(fā)酵麥麩中的細(xì)菌分布在4 個門，10 個屬，且存在部分細(xì)菌16S rDNA序列未能分類。在真菌方面，4 組樣品共獲得291 個OTU，發(fā)酵麥麩中的真菌分布在4 個門，13 個屬。

麥麩發(fā)酵過程中，細(xì)菌和真菌菌群高度豐富，有大量未命名的且不可培養(yǎng)的微生物，且不同樣品之間存在一定的差異。在1#樣品中，Proteobacteria是絕對優(yōu)勢菌門，而Firmicutes是其他3 個back-slopping樣品中的絕對優(yōu)勢菌門。屬水平上1#樣品中Cronobacter、Pantoea、Enterobacter和Clostridium為優(yōu)勢菌，3#、5#和7#樣品中Lactobacillus和Pediococcus是絕對優(yōu)勢菌屬。1#樣品和其他3 個樣品不論是在門或?qū)偎缴衔⑸锶郝浣M成都存在比較大的差異，這種差異可能是因為發(fā)酵方式不同造成，1#樣品是通過自然發(fā)酵獲得的發(fā)酵麥麩樣品，而其他3 個樣品是以1#樣品為發(fā)酵菌劑通過back-slopping方式獲得的自然發(fā)酵麥麩。有研究者認(rèn)為back-slopping方式消除了種共存中的擴散限制，選擇了具有高度競爭性的菌群[16]。Manini等[8]在麥麩自然發(fā)酵過程中（18 ℃，24 h）發(fā)現(xiàn)彎曲乳桿菌和戊糖乳桿菌作為麥麩內(nèi)源細(xì)菌并且直至發(fā)酵結(jié)束一直占據(jù)主導(dǎo)地位；Abedfar等[17]在自然發(fā)酵的伊朗北部麥麩中發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和片球菌為主要菌群，并且它們產(chǎn)胞外多糖能力也大不相同。由此可見，乳酸菌廣泛存在于麥麩發(fā)酵過程中，這可能與乳酸菌的代謝和生理學(xué)特性有助于其在發(fā)酵中進行競爭性生長相關(guān)[18]。麥麩發(fā)酵是一個相對開放的發(fā)酵過程，其麥麩原料并未經(jīng)過任何篩選和滅菌處理，所以在發(fā)酵過程中可能存在大量雜菌生長的現(xiàn)象，從而影響到發(fā)酵麥麩的品質(zhì)。麩皮表面有比胚乳面粉含量更多的微生物，它們可能是腐敗細(xì)菌和真菌的來源[19]。本研究中，在發(fā)酵第1批次的麥麩內(nèi)檢測到大量Enterobacter和Clostridium等有害菌存在，但在后續(xù)的轉(zhuǎn)接發(fā)酵過程中僅檢測到微量，這說明此發(fā)酵過程中的微生態(tài)環(huán)境變化，尤其pH值的降低（大量乳酸菌生長產(chǎn)生有機酸酸所致），能夠有效抑制有害菌的生長繁殖[20]。Katina等[21]在用酵母發(fā)酵黑麥的過程中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源乳酸菌的大量生長以及其產(chǎn)生的大量有機酸和抗菌物質(zhì)，限制了其他需氧異養(yǎng)細(xì)菌的生長。這些結(jié)果與普遍接受的觀點一致，即傳統(tǒng)發(fā)酵由少數(shù)微生物物種主導(dǎo)，這些微生物物種是在發(fā)酵過程中基于食物基質(zhì)特性和適應(yīng)自身生理代謝而選擇的[22]。

麥麩發(fā)酵過程中的真菌在屬水平上主要有Aspergillus和Alternaria。Alternaria是一種常見的植物致病菌，可引起食物霉變，但同時也是一種有應(yīng)用潛力的生物資源，如某些鏈格孢種高產(chǎn)纖維素酶，這對于改善谷物膳食纖維含量具有良好作用。Aspergillus也是一種重要的發(fā)酵菌，廣泛應(yīng)用于制曲、釀酒等方面，其所屬的部分菌種高產(chǎn)蛋白酶，糖化酶等有利于發(fā)酵過程中生物活性物質(zhì)的增加[23]。本研究檢測到的某些真菌如Penicillium和Fusarium是谷物中的常見腐敗菌。在麥麩發(fā)酵的后期，其種類和數(shù)量都急劇降低，這可能與乳酸菌的大量繁殖生長相關(guān)。乳酸菌能夠產(chǎn)生細(xì)菌素、乳酸、乙酸和過氧化氫等抗細(xì)菌和抗真菌化合物，可以防止食品腐敗并延長食品的保質(zhì)期[24]。Lavermicocca等[25]發(fā)現(xiàn)Lactobacillus能夠產(chǎn)生抗真菌的苯基乳酸，它可以延遲黑曲霉和青霉菌生長達7 d，并顯著延長面包的保質(zhì)期。在本研究中，并未檢測出酵母菌屬的存在，而在以往的發(fā)酵麥麩研究中，經(jīng)?？梢詸z測到酵母菌的存在。Manini等[8]在自然發(fā)酵的意大利麥麩中發(fā)現(xiàn)有畢赤酵母（Pichia pastoris）存在；Berghofer等[26]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌、酵母菌和霉菌是澳大利亞小麥中最常檢測到的微生物，這些可能與麥麩的種類、產(chǎn)地和儲藏環(huán)境等因素相關(guān)。在麥麩發(fā)酵研究中發(fā)現(xiàn)，整個發(fā)酵過程中樣品細(xì)菌的Shannon指數(shù)低于真菌，說明發(fā)酵麥麩樣品中細(xì)菌的多樣性不如真菌，但細(xì)菌的Chao1指數(shù)整體高于真菌，說明發(fā)酵樣品中細(xì)菌的豐度遠(yuǎn)高于真菌，且隨發(fā)酵批次增加，細(xì)菌中以Lactobacillus和Pediococcus等有益菌為主，Alternaria等致病菌豐度逐漸降低，說明對麥麩進行不同批次自然發(fā)酵可以改變其微生物菌群多樣性及豐度，抑制有害菌的生長，這說明發(fā)酵環(huán)境條件越來越具有選擇性，最終適合于少數(shù)菌種的生長[27]，也表明更新批次、發(fā)酵時間或pH值會影響某些菌種的優(yōu)勢[28]，這與Menezes等[29]對酸面團中細(xì)菌群落變化的趨勢一致。Menezes等[29]還發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵溫度對酸面團中菌群的變化起著重要的作用，就本研究而言，這需要后續(xù)進一步的實驗探究。

研究采用高通量測序分析方法對傳統(tǒng)自然發(fā)酵麥麩和back-slopping自然發(fā)酵麥麩的微生物群落組成和多樣性進行分析。結(jié)果表明，不同發(fā)酵方式會影響麥麩中優(yōu)勢菌群的種類及組成比例。在門水平菌群變化中，隨backslopping發(fā)酵批次可以有效增加細(xì)菌中Firmicutes含量，減少Proteobacteria的含量；真菌方面Asconycota是整個發(fā)酵過程中的絕對優(yōu)勢菌，但其多樣性隨back-slopping發(fā)酵批次增加變得豐富。在屬水平菌群變化中，隨back-slopping發(fā)酵批次增加，麥麩中Enterobacter、Cronobacter、Clostridium等有害菌減少，Lactobacillus和Pediococcus成為優(yōu)勢菌；真菌方面Aspergillus相對豐度降低，Alternaria相對豐度有所增加。整體而言，back-slopping發(fā)酵能提高麥麩的微生物菌群多樣性，在一定程度上促進有益菌的增加，并抑制有害菌的生長繁殖。故這種發(fā)酵方式有利于谷物麥麩中乳酸菌的逐步篩選，并加速發(fā)酵，縮短發(fā)酵時間，具有適用于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢。目前的大多數(shù)研究主要集中于發(fā)酵麥麩中乳酸菌和酵母菌的作用，忽略了其他菌群的作用，關(guān)于谷物麩皮酸面團樣品發(fā)酵過程中微生物菌群變化研究應(yīng)該促進非典型微生物方面的探討，包括潛在致病菌及其對發(fā)酵麥麩品質(zhì)的影響。考慮到麥麩中含有膳食纖維、多酚等生物活性物質(zhì)，發(fā)酵過程中細(xì)菌和真菌的豐富度和多樣性變化趨勢定會對麥麩發(fā)酵產(chǎn)品中的活性成分產(chǎn)生影響，因此后期將對麥麩產(chǎn)品發(fā)酵過程中成分變化進行深入研究。