靳登鵬，周 雄，劉 煥，楊 嬌，黃卓權，卜玲玲，柯倩華，柳春紅

（華南農業(yè)大學食品學院，廣東省食品質量安全重點實驗室，農業(yè)農村部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（廣州），廣東 廣州 510642）

嬰兒期是人類一生中十分特殊的階段，其生長、智力發(fā)育最為迅速，需要特殊的營養(yǎng)物質[1]。在嬰兒的胃腸道發(fā)育、免疫功能等方面，營養(yǎng)素發(fā)揮十分重要的作用[2]。 母乳是新生兒最重要的食物，其獨特的營養(yǎng)物質、免疫和抗感染因子等都有助于滿足生長發(fā)育的關鍵需求[3]，特別是母乳中的蛋白質更是與嬰兒的健康、生長和發(fā)育密切相關[4-7]。世界衛(wèi)生組織建議在嬰兒出生后的前6 個月，嬰兒唯一的營養(yǎng)來源應該是母乳，而母乳作為嬰兒營養(yǎng)的主要來源應該繼續(xù)持續(xù)1～2 a[8]。但是半歲左右的嬰兒單靠母乳喂養(yǎng)不能滿足其生理需求，必須通過添加輔食攝取額外的營養(yǎng)素和能量[2]，目前一般選擇嬰幼兒配方奶粉作為營養(yǎng)補充食物。乳蛋白作為母乳中最主要的成分之一，對嬰幼兒的健康成長具有非常重要的作用。

研究[9-11]表明，母乳中的蛋白質是由酪蛋白、乳清蛋白、乳脂球膜蛋白和乳外泌體組成。隨著蛋白質組學技術的不斷發(fā)展，越來越多的人開始熱衷于乳清蛋白質組學研究。乳清蛋白是母乳脫脂去除酪蛋白后，上清液中所含有的蛋白質，主要含有α-乳白蛋白、蛋白酶、免疫球蛋白等[12-15]，還含有具有重要生物學特定功能的低豐度蛋白，它主要參與新陳代謝、轉錄和翻譯等多種生理及病理過程[16]。在利用蛋白質組學技術分析低豐度蛋白時，質譜中的信號易被高豐度蛋白所影響，如何除去高豐度蛋白顯得尤為重要。Yamada等[17]通過免疫吸附的方法除去牛奶中的β-酪蛋白及免疫球蛋白后，發(fā)現(xiàn)了特異的低豐度蛋白質；Holland等[18]利用半胱氨酸標簽法移除了乳清中的αs1-酪蛋白和β-酪蛋白后，對其他類型的酪蛋白進行了分析。

由于母乳中還有大量低豐度蛋白的生理功能尚不清楚，而且國內關于免疫親和層析和ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒2 種方法去除母乳中高豐度蛋白的報道較少。因此，本研究通過免疫親和層析和ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒2 種前處理方法除去部分高豐度蛋白，富集低豐度蛋白，最后經過LTQ Orbitrp Velos質譜儀檢測，并進行相關的生物信息分析，研究結果將有助于加深對人類乳蛋白質組的了解，為嬰幼兒的健康成長和疾病預防提供理論依據，同時也可為母乳喂養(yǎng)的保護作用機制及有關乳腺疾病的研究提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

日齡80～90 d的雌性白兔購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心（三水基地），實驗動物許可證號SCXK（粵）2014-0035，體質量1.8～2.2 kg。

成熟乳（1 月左右的混合母乳）來源于北京大學醫(yī)學部，采集于北京地區(qū)的母親。

磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、 2-巰基乙醇（均為分析純）、碳酸氫銨（分子生物級） 天津科密歐試劑有限公司；碘乙酰胺、二硫蘇糖醇、四甲基乙二胺（均為分子生物級），乙腈、甲酸（均質譜級），十二烷基硫酸鈉（分析純） 上海麥克林生化科技有限公司；甘氨酸（分析純） 德國Biofroxx 公司；三羥甲基氨基甲烷（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；胰蛋白酶（質譜級） 美國Sigma公司； 甲酸（質譜級） 梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；ProteinA/G agarose（分析純） 上海翊圣生物科技有限公司；CNBr-活化的Sepharose 4B（分析純） 上海信帆生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

ProteoMiner 低豐度蛋白富集試劑盒、電泳儀 Bio-Rad中國公司；LTQ Orbitrp Velos質譜儀 美國Thermo Fisher公司；LC-20A高效液相色譜 日本島津有限公司；5810R臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司；MDF-192超低溫冰箱 松下電器（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 母乳多克隆抗體的制備

將母乳在4 ℃、10 000 r/min離心20 min，除去上層的脂質層，收集其乳清部分并與完全福氏佐劑乳化（終質量濃度4 mg/mL），對白兔進行皮下多點注射（免疫劑量為1.25 mg/mL），在初次免疫后的第4、6、8周分別以等量的抗原與非完全福氏佐劑乳化，加強免疫后的第10天取血測效價，當效價達到105以上時，心臟取血，得到的兔血在37 ℃水浴中靜置30 min，然后在4 000 r/min離心30 min，吸取上清液，分裝凍存于-80 ℃冰箱中[19]。

1.3.2 母乳多克隆抗體的純化

將血清從-80 ℃取出，待樣品溶解后，過0.22 μm的聚醚砜濾膜過濾，收集過濾后的濾液。取1 mL左右的Protein A/G agarose填料裝入層析柱中，先用5～10 倍柱體積的洗滌緩沖液（0.15 mol/L氯化鈉、20 mmol/L磷酸二氫鉀）洗去殘存的乙醇。將過濾后的血清反復上柱孵育，接著用洗滌緩沖液（0.15 mol/L氯化鈉、20 mmol/L磷酸氫二鈉）洗去雜蛋白，再用洗脫緩沖液（0.1 mol/L甘氨酸）洗脫抗體[19]。

1.3.3 母乳免疫親和層析

將純化的抗體在偶聯(lián)緩沖液（0.1 mol/L碳酸氫鈉，pH 8.3）中4 ℃透析并與CNBr-活化的Sepharose 4B偶聯(lián)裝柱。向得到的母乳乳清中加入蛋白酶抑制和氯化鈣溶液，將乳清中氯化鈣濃度調整成0.06 mol/L，用鹽酸將樣品的pH值調至4.6[20]，樣品在室溫下孵育1 h。然后4 ℃、13 000×g離心30 min，重復1 次，收集上清液過0.22 μm濾膜，樣品在室溫下孵育30 min過柱，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌出大部分未與抗體結合的乳清蛋白，收集此階段的溶液作為去除高豐度蛋白的母乳，再用PBS溶液充分洗滌免疫親和柱，待基線洗平時，用pH 2.4 0.1 mol/L的甘氨酸溶液洗脫與抗體結合的乳清蛋白，然后平衡及再生免疫親和層析柱[21]。將收集到的樣本透析到PBS內，并對樣本用PEG20000包埋濃縮。濃縮完成后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，驗證免疫親和層析的效果。

1.3.4 ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒處理

母乳樣本經過凍干、復溶，使樣品中蛋白質的質量濃度達50 mg/mL以上，參照說明書操作，收集此階段的液體，所得到的濾液經SDS-PAGE驗證效果。

1.3.5 SDS-PAGE分析

每個樣本取12 μL，加入3 μL的5 倍體積上樣緩沖液，旋渦混勻，在沸水中水浴5 min，10 000×g離心5 min，取上清液，每孔上樣10 μg蛋白。進行10%的分離膠SDS-PAGE，設置電泳儀恒流30 mA，時間30 min，電泳完成后，振蕩染色30 min，脫色至背景透明，進行凝膠成像儀拍照。

1.3.6 乳清蛋白液相色譜-質譜分析的前處理

將脫色好的膠先用500 mL乙腈脫水，風干乙腈，加入2 倍體積10 mmol/L二硫蘇糖醇溶液，56 ℃水浴1 h，冷卻吸干，加入55 mmol/L碘乙酰胺避光45 min，清洗脫水，加入胰蛋白酶液，4 ℃靜置30 min，再37 ℃孵育過夜。加入5 倍體積50%乙腈溶液，5 000×g離心1 min，將上清液移至離心管中，重復2 次，真空冷凍干燥。抽干的肽段樣品用2%乙腈-0.1%甲酸溶液復溶，4 ℃、25 000×g離心20 min后，取上清液進樣分析。

1.3.7 儀器測定條件

液相色譜分離：通過L C-2 0 A 高效液相色譜儀進行分離。樣品首先進入trap柱富集并除鹽，隨后與自裝C18柱（15 cm×75 μm，3.6 μm）串聯(lián)，以300 nL/min流速通過如下有效梯度進行分離：流動相A（2%乙腈-0.1%甲酸溶液）、流動相B（98%乙腈-0.1%甲酸溶液），0～8 min，95% A、5% B；8～43 min，92%～65% A、8%～35% B；43～48 min，6 5%～4 0% A、3 5%～6 0% B；4 8 ～5 0 m i n，40%～20% A、60%～80% B；50～55 min，20% A、80% B；55～65 min，95% A、5% B。納升液相分離末端直接連接質譜儀[22-23]。

質譜檢測：經過液相分離的肽段通過nano電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）源離子化后進入到串聯(lián)質譜儀LTQ Orbitrap Velos進行數據依賴性采集模式檢測。主要參數設置：nano離子源電壓設置為1.8 kV。一級質譜掃描范圍m/z350～1 500，分辨率設置為30 000；二級質譜起始m/z固定為100，分辨率設置為7 500。進行二級碎裂的母離子篩選條件為：電荷2＋、3＋和4＋以上，峰強度超過1 000并且排在前12的母離子。高能碰撞解離碰撞能量設置為35，碎片離子在Orbitrap中進行檢測。動態(tài)排除時間設定為15 s。自動增益控制設置為：一級1×106，二級5×104[24]。

1.3.8 質譜數據分析

使用Homo sapiens基因組作為參考，Mascot v2.3.02進行搜庫鑒定，參數見表1。使用DAVID軟件進行Gene Ontology（GO）功能注釋分析、Pathway途徑分析和Cluster of Orthologous Groups of proteins（COG）分析[25-26]。

表1 Mascot搜索參數Table 1 Mascot search parameters

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE分析

如圖1所示，抗體血清經過Protein A/G agarose純化后，血清中除特異性免疫球蛋白（主要是IgG）以外的多種無關蛋白被去除，在25 kDa和50 kDa出現(xiàn)對應的IgG輕鏈和重鏈，純化效果較好。經過免疫親和柱處理后的樣品在對應的蛋白條帶有所減弱，說明免疫親和柱能在一定程度上去除高豐度蛋白，洗脫部分也有對應的蛋白條帶。ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒處理樣本的SDSPAGE如圖1所示，經過ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒處理后，35～70 kDa之間有多條新的條帶顯現(xiàn)出來，同時在10、25、170 kDa相對應的條帶變淺，上述結果表明ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒不僅能富集一些低豐度蛋白，同時能在一定程度上去除高豐度蛋白，試劑盒處理效果較好。

圖1 不同處理后的母乳乳清蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE profiles of breast milk whey proteins with different treatments

2.2 質譜檢測結果

將母乳樣品分別經過免疫親和層析和低豐度蛋白富集試劑盒前處理，除去部分高豐度蛋白，最后經過LTQ Orbitrp Velos質譜儀檢測，如圖2所示，免疫親和層析法鑒定49 種蛋白質，ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒鑒定出172 種蛋白質，2 種方法總共鑒定186 種蛋白質，其中有49 種蛋白質在母乳中鮮有報道。

圖2 2 種方法乳清蛋白的Venn圖Fig. 2 Venn diagram showing shared and unique whey protein components identified by the two methods

2.2.1 母乳乳清蛋白的GO注釋分析

對蛋白質功能性質的研究有助于提高對乳蛋白質的利用和認識[27]。為進一步認識母乳中的乳清蛋白質，將鑒定的186 種蛋白質進行GO注釋分析，分別對其細胞成分、生物途徑以及分子功能3 個方面的信息進行歸類[28]。 如圖3所示，在母乳的乳清蛋白中，13.04%集中在細胞部分、11.96%在細胞外區(qū)域、13.22%在細胞器、8.24%在膜部分；蛋白參與了很多生物途徑，其中有8.5%的蛋白參與生物調節(jié)、9.04%的蛋白參與代謝過程，10.95%的蛋白參與細胞過程，7.12%的蛋白參與本土化過程，其余蛋白分別參與了信號、刺激性反應、生物黏附等；母乳乳清中這些蛋白的分子功能主要是結合活性和催化活性，分別占蛋白的43.82%和27.21%，還有分子功能調節(jié)、分子傳感器活性等多個功能。

圖3 母乳乳清蛋白的GO注釋圖Fig. 3 GO functional annotation analysis of breast milk whey proteins

2.2.2 母乳乳清蛋白的Pathway分析

為更進一步了解母乳乳清蛋白的代謝路徑，采用DAVID在線分析平臺對母乳乳清蛋白進行Pathway分析。如表2所示，有181 個蛋白被識別，其中有12.71%的蛋白參與代謝途徑，有12.15%的蛋白參與PI3K-Akt信號通路，有12.15%的蛋白參與吞噬代謝途徑，有8.84%的蛋白參與磷脂酶D信號通路等，其余代謝路徑包括：癌癥中的轉錄失調、病毒性心肌炎、擴張型心肌病等，共有201 個代謝路徑。

表2 母乳乳清蛋白參與最多的13 個通路Table 2 Top 13 pathways in which breast milk whey proteins most participate

Pathway分析結果進一步說明，已經注釋功能的蛋白質可能參與嬰幼兒某種疾病發(fā)生的多種代謝途徑。

2.2.3 母乳乳清蛋白的COG分析

為更加清楚地了解母乳乳清蛋白質的功能，將鑒定到的186 種蛋白質和COG數據庫進行比對，預測這些蛋白質可能的功能并對其做功能分類統(tǒng)計。如圖4所示，有19 種蛋白質屬于碳水化合物的運輸和新陳代謝類蛋白，有13 種蛋白質屬于僅通用功能預測，有5 種蛋白質屬于信號轉導機制類蛋白，有4 種蛋白質屬于防御機制類蛋白等，其余功能分類有：能源生產和轉換、氨基酸轉運和代謝、核苷酸轉運和代謝等。上述結果表明，在1 月的母乳中，相關蛋白主要在碳水化合物的運輸和新陳代謝、功能預測、信號轉導等過程中起調控作用。

圖4 母乳乳清蛋白的COG分類Fig. 4 COG classification of breast milk whey proteins

3 討 論

本實驗以1 月左右的成熟乳為實驗材料，通過免疫親和層析和ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒2 種前處理方法除去部分高豐度蛋白，采用LTQ Orbitrp Velos質譜儀檢測，并進行相關生物信息學分析。

免疫親和層析處理和ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒處理都有去除部分高豐度蛋白效果，但是試劑盒的效果較好，這可能與制備的抗體有關。本實驗是由分離脂肪的母乳作為抗原，然后制備得到多克隆抗體，通過免疫得到的抗體在制備免疫親和柱之后能洗脫對應的蛋白，說明母乳中的酪蛋白、乳鐵蛋白、分泌性IgA以及α-乳白蛋白具有免疫原性，使動物產生了抗體，但是抗體產生與免疫原和免疫劑量有關，微量的低豐度蛋白依然存在產生相應抗體的可能，這些抗體的存在會導致其他蛋白的損失。根據已有的文獻，Holland等[18]利用半胱氨酸標簽法移除了αs1-酪蛋白和β-酪蛋白；楊梅[29]利用等電點的方法去除酪蛋白。本實驗的2 種方法除了去除酪蛋白以外，可能還去除了其他高豐度蛋白，對鑒定低豐度蛋白可能具有更大意義。

通過質譜檢測，免疫親和層析法處理后鑒定出49 種蛋白質，ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒處理后鑒定出172 種蛋白質，2 種方法共鑒定出186 種蛋白質。Panchaud等[30]采用分子過濾法和陰離子交換色譜柱富集了人乳中一些低豐度表達蛋白質，隨后利用SCX/RP進行分級，最終在乳清中定性了43 種蛋白質；Liao Yalin等[3]利用蛋白富集試劑盒處理母乳，然后基于1D-LC的蛋白質組學方法分離得到115 種蛋白質；Molinari等[31]利用蛋白富集試劑盒處理母乳，然后利用SDS-PAGE、熒光差異雙向電泳、一維基質輔助激光解吸電離、二維基質輔助激光解吸電離、同位素標記相對和絕對定量技術鑒定出415 種蛋白質。由于本實驗主要是比較2 種前處理方法除去高豐度蛋白、富集低豐度蛋白的效果，并通過蛋白質組學技術探索母乳中的重要活性蛋白，而不是單純?yōu)榱死猛凰貥擞浵鄬徒^對定量等技術去鑒定到更多的蛋白數，所以鑒定到的蛋白數有限。另外，Shen Yunfeng等[32]發(fā)現(xiàn)免疫親和層析技術在血清蛋白鑒定中會丟失一些低豐度的蛋白，這可能是這些蛋白與對應的基質發(fā)生非特異性結合；Molinari等[31]發(fā)現(xiàn)用ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒母乳樣品之后，一些中等豐度的蛋白質可能對六肽配體文庫具有非常低的結合親和力，并且不保留在ProteoMiner珠子上，實際上，蛋白質對ProteoMiner肽文庫的不同結合親和力已經被描述為該技術的主要限制之一，估計任何給定混合物中5%～15%的蛋白質可能完全沒有結合[33]。在蛋白質組學的研究中，任何一種方法不能完全發(fā)現(xiàn)目標物內的所有蛋白，只要該方法有促進蛋白質的發(fā)現(xiàn)并能與之前的方法相互補充，就有一定的研究意義。

參考已報道的文獻[3,19,31]，可能有49 種蛋白質未在母乳中檢測出。其中免疫球蛋白占18%，這表明人乳在保護嬰兒免受感染中起著至關重要的作用，盡管有大量文獻描述了母乳喂養(yǎng)對嬰兒的保護作用，但其機制還未闡明[34]。有14%的蛋白質具有促進生長發(fā)育的作用，如有絲分裂檢查點絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，對于紡錘體裝配檢查點信號傳遞和正確的染色體對齊至關重要[35]；Ras GTPase激活樣蛋白，在調節(jié)肌動蛋白細胞骨架的動力學和組裝中起關鍵作用，可能促進神經突生長[36]。還有14%的蛋白質目前鮮有報道。這也說明了本研究采用的免疫親和技術和ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒2 種前處理方法均具有一定分離出新蛋白的優(yōu)勢。

人乳中的某些蛋白質可用作炎癥和疾病的標志物。一些研究報道了乳腺炎期間免疫蛋白水平的變化，在乳腺炎發(fā)作期間，乳鐵蛋白、sIgA、分泌性白細胞蛋白酶抑制劑和血清白蛋白都被發(fā)現(xiàn)在人乳中存在較高水 平[37-38]。關于牛奶的研究也發(fā)現(xiàn)了許多免疫蛋白[39]，在本研究鑒定的蛋白質中，有15 種與腸道免疫網絡途徑相關，有22 種與吞噬途徑相關，有20 種與結核途徑相關等，這些都可能具有作為某些炎癥和疾病的標志物的潛力。

綜上所述，免疫親和技術和ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒可以增加蛋白質被檢測到的幾率，通過對這些蛋白質的研究，揭示母乳中有很多有生物活性的蛋白值得進一步探索，母乳喂養(yǎng)有不可替代的優(yōu)勢，并對配方奶粉的改進有重要意義。