楊登元,沈曉菲,陸曉峰,趙 陽,夏雪峰,管文賢,杜峻峰
腸源性膿毒癥是普外科常見的重癥疾病,發(fā)病率高,預(yù)后較差,其在早期存在的免疫抑制是導(dǎo)致預(yù)后不佳的主要因素[1-2]。中性粒細胞在腸源性膿毒癥中的生存時間顯著延長,然而自身功能卻出現(xiàn)明顯改變,在膿毒癥模型中,中性粒細胞能夠上調(diào)程序性死亡配體1(programmed death ligand 1, PD-L1)的表達,抑制淋巴細胞的功能[3];而在臨床研究中,重癥膿毒癥患者的外周血中性粒細胞PD-L1表達水平與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[4]。因此,中性粒細胞表達PD-L1是誘導(dǎo)其他免疫細胞功能抑制,推動膿毒癥免疫抑制狀態(tài)的重要環(huán)節(jié)。然而,中性粒細胞在膿毒癥患者中上調(diào)PD-L1表達的具體機制尚不清楚。固有淋巴細胞(innate lymphoid cells, ILCs)是最近發(fā)現(xiàn)的一類免疫細胞群體,在受到外源致病菌或炎癥刺激后,可通過表面的相應(yīng)受體啟動快速免疫應(yīng)答,因此對于早期免疫應(yīng)答起到了至關(guān)重要的調(diào)控作用[5]。雖然ILCs是組織定居細胞,但是研究人員發(fā)現(xiàn),在人類外周血中穩(wěn)定存在各亞型ILCs,提示其也能參與系統(tǒng)性免疫應(yīng)答[6]。腸源性膿毒癥患者在早期就存在復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò),不同亞型的ILCs可以被不同細胞因子激活,與此同時,激活的ILCs也能通過分泌細胞因子與蛋白促進疾病的發(fā)展。因此,ILCs可能是膿毒癥早期疾病進程中的關(guān)鍵細胞群體。本研究利用健康志愿者及腸源性膿毒癥患者外周血,提取免疫細胞后分析ILCs的變化及其對于中性粒細胞和腸源性膿毒癥免疫抑制的潛在調(diào)控作用。
1.1一般資料 選取2019年1月—9月南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院胃腸外科收治的7例因結(jié)腸穿孔所致腸源性膿毒癥患者,膿毒癥的診斷依據(jù)最新Sepsis-3的診斷標(biāo)準(zhǔn):序貫器官衰竭評估評分≥2分;所有患者在入院24 h內(nèi)即進行評分,年齡46~68歲,男3例,女4例。選取7例同期的健康志愿者,其中男4例,女3例,年齡38~72歲,既往無嚴(yán)重心、肝、腎、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)疾病,無放化療及免疫調(diào)節(jié)藥物或激素服用史。健康志愿者與腸源性膿毒癥患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。無論是患者還是志愿者都簽署知情同意書。
1.2外周血處理 獲取健康志愿者及腸源性膿毒癥患者外周血10 ml,加入Ficoll分離液,按照外周血∶PBS∶Ficoll分離液4∶4 ∶6的比例進行離心,室溫,30 min,上升速度最大,下降速度最低;離心后獲取薄霧狀中間層細胞,進行洗滌。
1.3流式細胞術(shù)及體外刺激共培養(yǎng) 人類外周血ILC2(2型固有淋巴細胞):CD45+Lineage-IL-7Rα+CRTH2+;分選后的細胞利用20%細胞培養(yǎng)基在體外使用人白介素-12(interleukin-12, IL-12)及IL-33刺激,濃度均為50 ng/ml,刺激3 d后分別獲取細胞和上清液以備檢測,細胞利用BD公司FACS CantoⅡ檢測,上清液應(yīng)用R&D公司生產(chǎn)的γ干擾素(interferon-γ, IFN-γ)試劑盒進行檢測;在部分實驗中,加入流式細胞術(shù)分選的中性粒細胞,再培養(yǎng)12 h后檢測中性粒細胞表面PD-L1的表達。
2.1腸源性膿毒癥患者外周血ILCs亞群的變化 無論是健康志愿者還是腸源性膿毒癥患者,外周血內(nèi)均存在3型ILCs:ILC1、ILC2和ILC3。見圖1A。與健康志愿者比較,腸源性膿毒癥患者外周血ILC1比例顯著上升,而ILC2的比例則顯著下調(diào)(P<0.05),ILC3的比例則變化不顯著(P>0.05)。見圖1B和表1。提示在腸源性膿毒癥早期,ILCs的亞群就存在顯著變化,可能對疾病的發(fā)生發(fā)展起到推動作用。
表1 健康志愿者及腸源性膿毒癥患者外周血ILCs亞群比較
2.2腸源性膿毒癥患者外周血中性粒細胞PD-L1表達情況 分析健康志愿者與腸源性膿毒癥患者外周血中性粒細胞發(fā)現(xiàn),健康志愿者外周血中性粒細胞幾乎不表達PD-L1,然而在腸源性膿毒癥患者體內(nèi),中性粒細胞PD-L1表達顯著上調(diào)。見圖2A。在過去研究中,巨噬細胞和樹突狀細胞是表達PD-L1的主要固有免疫細胞群體,然而在腸源性膿毒癥早期,中性粒細胞是表達PD-L1最顯著的細胞群體(P<0.05)。見圖2B。提示PD-L1對后續(xù)免疫抑制的發(fā)生起到重要推動作用。
圖2 健康志愿者及腸源性膿毒癥患者外周血中性粒細胞PD-L1表達情況
2.3腸源性膿毒癥患者中性粒細胞PD-L1表達水平與ILC1比例的相關(guān)性 為了探索ILC2與ILC1比例的變化,尤其是ILC1比例的顯著上調(diào)是否對腸源性膿毒癥免疫抑制產(chǎn)生影響,本研究對中性粒細胞PD-L1表達水平與ILC1比例進行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)中性粒細胞PD-L1表達水平與ILC1比例呈正相關(guān)(R2=0.5959)。見圖3。提示ILCs可能參與中性粒細胞在腸源性膿毒癥早期上調(diào)PD-L1的表達。
2.4體外IL-33和(或)IL-12刺激ILC2可以轉(zhuǎn)變?yōu)镮LC1 為了探索ILC1比例增加的原因,及其是否能直接作用于中性粒細胞,促進PD-L1的表達并導(dǎo)致膿毒癥免疫抑制,本研究首先運用體外實驗,探索ILC2是否能被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)镮LC1,將獲取的外周血ILC2在體外分別運用IL-33、IL-12及IL-12+IL-33刺激,發(fā)現(xiàn)在體外IL-12或IL-12+IL-33刺激下,ILC2確實能夠轉(zhuǎn)變?yōu)镮LC1,ILC1特征性轉(zhuǎn)錄因子T-bet高表達(P<0.05),上清液亦可檢測到高水平的IFN-γ(P<0.05)。當(dāng)將中性粒細胞與由ILC2轉(zhuǎn)變而來的ILC1共培養(yǎng)后,中性粒細胞PD-L1的表達顯著上調(diào)(P<0.05)。見圖4。提示腸源性膿毒癥早期,ILC2能轉(zhuǎn)變?yōu)镮LC1,促進中性粒細胞表達PD-L1,推動腸源性膿毒癥免疫抑制的產(chǎn)生。
深入闡明腸源性膿毒癥的病理生理過程是治療疾病,改善預(yù)后的前提。目前學(xué)者們一致認(rèn)為,腸源性膿毒癥是病原菌與機體免疫系統(tǒng)相互較量的過程;機體在抗菌的同時啟動促炎反應(yīng),作為一種代償機制,機體內(nèi)同時或相繼出現(xiàn)抗炎反應(yīng):效應(yīng)性T細胞出現(xiàn)凋亡、中性粒細胞功能失調(diào)、內(nèi)毒素重新整合、MHC-2類分子在抗原提呈細胞表面表達下調(diào)、調(diào)節(jié)性T細胞以及髓系抑制性細胞比例上調(diào)等。因此部分學(xué)者認(rèn)為增強機體免疫功能、逆轉(zhuǎn)腸源性膿毒癥早期即存在的免疫抑制才是新的治療方向[2]。ILCs作為最近新發(fā)現(xiàn)的免疫細胞群體,數(shù)量雖少,但是因其在炎癥與感染早期能夠被快速激活,成為現(xiàn)今免疫細胞群體的關(guān)注焦點;然而其在腸源性膿毒癥中扮演的角色尚未闡明。本研究初步證實,在腸源性膿毒癥早期,ILCs各亞群就存在變化,ILC1的比例顯著上調(diào),而ILC2的比例則顯著下調(diào),進一步的體外實驗表明,ILC1比例的上調(diào)可能與ILC2/ILC1轉(zhuǎn)化有關(guān);本研究還發(fā)現(xiàn),腸源性膿毒癥患者外周血中性粒細胞在早期就顯著上調(diào)PD-L1的表達,并且其表達水平與ILC1的比例呈現(xiàn)顯著的正相關(guān);進一步的體外共培養(yǎng)實驗證實,ILC2轉(zhuǎn)變?yōu)镮LC1后,確實能顯著上調(diào)腸源性膿毒癥患者外周血中性粒細胞PD-L1表達。因此上述結(jié)果提示,ILCs在腸源性膿毒癥早期就存在ILC2/ILC1轉(zhuǎn)化,促進中性粒細胞表達PD-L1,從而推動免疫抑制的產(chǎn)生。
圖3 腸源性膿毒癥患者中性粒細胞PD-L1表達水平與ILC1比例的相關(guān)性
圖4 體外IL-33和(或)IL-12刺激ILC2后T-bet、IFN-γ以及中性粒細胞PD-L1表達情況
中性粒細胞作為體內(nèi)數(shù)量最多的免疫細胞群體,在膿毒癥中的作用一直是研究的熱點。由于中性粒細胞的生存期限與其他免疫細胞尤其是記憶性細胞相比,相對短暫,因此過去認(rèn)為中性粒細胞主要是終末效應(yīng)性細胞,對于其他細胞的調(diào)控作用甚微。然而最近的研究表明,在炎癥狀態(tài)下,中性粒細胞在外周循環(huán)及感染灶都能與獲得性免疫細胞(例如T淋巴細胞)相互聯(lián)系,并且對T淋巴細胞的功能進行調(diào)控。中性粒細胞能通過分泌活性氧和精氨酸-1對淋巴細胞的功能起到負調(diào)控作用[7]。PD-L1作為下調(diào)淋巴細胞免疫功能的重要抑制性分子,是表達于T淋巴細胞表面PD-1的配體,一旦與PD-1結(jié)合能啟動T淋巴細胞凋亡與功能抑制。隨著研究的深入,研究人員發(fā)現(xiàn)哮喘患者痰液中性粒細胞及HIV感染患者外周血中性粒細胞能高表達PD-L1,并對淋巴細胞功能起到抑制作用[8-9];而在膿毒癥中,無論是動物模型還是人類試驗結(jié)果均證實,中性粒細胞在早期就能通過表達PD-L1誘導(dǎo)T細胞的凋亡,促進免疫抑制的產(chǎn)生,然而調(diào)控腸源性膿毒癥早期中性粒細胞上調(diào)PD-L1的細胞學(xué)機制尚未揭示。本研究結(jié)果則初步證實,ILCs是腸源性膿毒癥早期誘導(dǎo)中性粒細胞上調(diào)PD-L1表達的主要細胞群體。
ILCs對于中性粒細胞的調(diào)控主要集中在ILC3,其通過分泌粒細胞集落刺激因子和IL-17A,對中性粒細胞在體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[10];而在重癥哮喘這一炎癥疾病狀態(tài)下,ILC2可以轉(zhuǎn)變?yōu)榉置贗L-17A的炎性ILC3,促進中性粒細胞在重癥哮喘狀態(tài)下肺部的浸潤,促進哮喘的急性發(fā)作[11]。ILCs是否能通過其他調(diào)控機制介導(dǎo)與中性粒細胞間的相互作用尚不明確,基于ILCs和中性粒細胞均是機體抵御外界病原菌侵入的首道防線,探索二者在炎癥狀態(tài)下,例如膿毒癥模型中的相互作用,或許是新的思路。另外,不同亞型ILCs在依靠分泌多種細胞因子和蛋白發(fā)揮作用的同時,也能相互轉(zhuǎn)化[12]。這種轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是機體免疫系統(tǒng)為了適應(yīng)外界刺激而產(chǎn)生積極有效的免疫應(yīng)答,例如在腸道損傷與感染中,腸道ILC3也可以轉(zhuǎn)變?yōu)镮LC1,促進免疫應(yīng)答的發(fā)展[5];然而這種ILCs間的轉(zhuǎn)化如無法得到逆轉(zhuǎn),也會出現(xiàn)有害的一面,例如在慢性阻塞性肺疾病中,ILC2可以轉(zhuǎn)變?yōu)榉置贗FN-γ的ILC1,加重呼吸道損傷[13]。在克羅恩病患者的腸道組織中,發(fā)現(xiàn)存在分泌IL-13及IFN-γ的ILCs,并且其數(shù)量及比例與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[14]。本研究則發(fā)現(xiàn),在腸源性膿毒癥早期,ILC2可以轉(zhuǎn)變?yōu)榉置贗FN-γ的ILC1,推動腸源性膿毒癥免疫抑制的產(chǎn)生。這一結(jié)果,為ILCs在疾病狀態(tài)下的相互轉(zhuǎn)化理論做出了有效擴充,下一步深入探索調(diào)控ILCs間相互轉(zhuǎn)化的內(nèi)在分子機制,將為早期阻斷腸源性膿毒癥免疫抑制的產(chǎn)生,改善患者的預(yù)后提供新的方向。