彭穎征 鄧侃

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者選擇以鼠傷寒沙門氏菌作為藥物載體進(jìn)行腫瘤的分子靶向治療[1-4]。其理論基礎(chǔ)主要依據(jù)鼠傷寒沙門氏菌在實(shí)體瘤乏氧區(qū)的特異性[5]。研究表明[6]，靶向性藥物很難通過(guò)系統(tǒng)給藥方式進(jìn)入到腫瘤的乏氧區(qū)，這是目前腫瘤靶向藥物實(shí)現(xiàn)高效靶向運(yùn)輸需要解決的難題之一，相反，一些厭氧類微生物（如傷寒沙門氏菌）可特異性大量定植于腫瘤組織間的乏氧區(qū)，成為抗腫瘤分子靶向治療的最佳候選載體[7-8]。因此利用scFv78選擇性攜帶某些治療性物質(zhì)（如人源化毒素DNAse Ⅰ）與VNP20009雙靶向遺傳性狀穩(wěn)定的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等腫瘤微環(huán)境，從而為患者量身打造個(gè)體化的治療方案。

1 材料和方法

1.1 一般材料

MS1、MS1-TEM1細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pET302-Gala-DNAse Ⅰ-78、pET302-Gala-SV40-DNAse Ⅰ-78、pET302-Gala-M9-DNAse Ⅰ-78和pET302-Gala-BIF-DNAse Ⅰ-78由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit I購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司。10 kb plus DNA ladder購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建減毒鼠傷寒沙門重組菌 將pET302-Gala-DNAseⅠ-78、pET302-Gala-SV40-DNAse Ⅰ-78、pET302-Gala-M9-DNAse Ⅰ-78、pET302-Gala-BIF-DNAse Ⅰ-78這四種質(zhì)粒各取1 μL于1.5 mL的離心管中，將其和0.1CM的電極杯一起置于冰上預(yù)冷。打開(kāi)電轉(zhuǎn)儀，將此混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電極杯中，取20 μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加160 μL SOC涂板，放于37℃溫室，過(guò)夜培養(yǎng)，次日查看后篩選可在含氨芐的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆。

1.2.2 重組蛋白的表達(dá)及功能驗(yàn)證 挑取克隆在LB（含氨芐抗生素）液體培養(yǎng)基中小量培養(yǎng)細(xì)菌并破碎，用親和層析法（目的蛋白有六個(gè)組氨酸標(biāo)簽可用于蛋白純化）分離純化細(xì)菌包涵體中的目的蛋白，緩慢加入到復(fù)性液（2M的尿素），36～48 h，8 000 r/min離心后濃縮至合適體積按1∶4的比例與His beads結(jié)合，通過(guò)SDS-PAGE和Western-blot鑒定目的蛋白位置和大小，在膜表面加入顯色液凝膠成像儀里顯色。

1.2.3 體外評(píng)價(jià)重組蛋白抑殺細(xì)胞的能力 通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)驗(yàn)證目的蛋白對(duì)MS1-TEM1細(xì)胞的特異性和對(duì)DNA降解能力后，培養(yǎng)MS1和MS1-TEM1細(xì)胞，加入不同濃度的重組蛋白，設(shè)置濃度梯度，0 nM，15 nM，30 nM，60 nM，0.125 μM，0.25 μM，0.50 μM，1.00 μM。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白對(duì)MS1-TEM1的特異性靶向效果

將重組蛋白與不表達(dá)TEM1的MS1細(xì)胞和表達(dá)TEM1的MS1-TEM1細(xì)胞共孵育，結(jié)果顯示，所有重組蛋白與MS1細(xì)胞均無(wú)特異性結(jié)合效果（如圖1、2所示）。對(duì)MS1-TEM1細(xì)胞而言，帶有scFv78的蛋白其他表達(dá)載體皆可特異性與MS1-TEM1細(xì)胞相結(jié)合。

圖1 重組蛋白對(duì)MS1細(xì)胞的靶向作用

2.2 重組蛋白對(duì)DNA的消化實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所構(gòu)建的蛋白均可徹底降解溶液中的DNA，其降解效果與商品化DNAse Ⅰ無(wú)差別（如圖3所示）。

3 討論

目前，腫瘤治療主要以手術(shù)治療為主，術(shù)后根據(jù)臨床分期及組織學(xué)類型等決定是否輔以放化療等防止復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。該類療法的缺點(diǎn)主要是對(duì)浸潤(rùn)型腫瘤無(wú)法做到根治，且放射線和化療藥物會(huì)同時(shí)傷害到人體的正常細(xì)胞，給患者身體造成較嚴(yán)重的傷害[9]。因此，歐美等國(guó)家建議限制放化療在癌癥治療領(lǐng)域的應(yīng)用[10]。隨著醫(yī)學(xué)科技的進(jìn)步，越來(lái)越多的腫瘤患者選擇靶向性藥物進(jìn)行治療[11]，其對(duì)健康組織影響較小，是目前最理想的治療模式，也代表著腫瘤治療的未來(lái)趨勢(shì)。

前期通過(guò)構(gòu)建一系列表達(dá)載體pET302-Gala-DNAse Ⅰ-78、pET302-Gala-SV40-DNAse Ⅰ-78、pET302-Gala-M9-DNAse Ⅰ-78和pET302-Gala-BIF-DNAse Ⅰ-78，其中，組件Gala為逃逸序列，有助于蛋白進(jìn)入細(xì)胞后避免被囊泡吞噬而失去殺傷效果；組件SV40、M9、BIF為核定位序列，有助于蛋白進(jìn)入細(xì)胞后特異性靶向細(xì)胞核基因組，降解DNA從而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。

scFv78為篩選得到的單鏈抗體，可使蛋白特異性聚集在表達(dá)TEM1的腫瘤微環(huán)境，是生物藥物的導(dǎo)航系統(tǒng)；DNAse Ⅰ為DNA降解酶，可降解單鏈和雙鏈DNA，是生物藥物的炸藥[12]。將前期篩選得到的、可特異性靶向腫瘤標(biāo)示分子TEM1的單鏈抗體基因scFv78與人源化毒素DNAse Ⅰ通過(guò)電轉(zhuǎn)化將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009中，篩選陽(yáng)性克隆后通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該人源化融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向效果，總之本研究結(jié)合篩選到的特異性靶向腫瘤標(biāo)示分子TEM1，可達(dá)到“雙靶向”的治療效果，為以后的腫瘤治療提供了新思路。

圖2 重組蛋白對(duì)MS1-TEM1細(xì)胞的靶向作用

圖3 重組蛋白對(duì)DNA的消化實(shí)驗(yàn)