王浩先，王世界，王祥玉，倪宏波

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163000； 2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院)

近年來，牛病的種類相對(duì)增多，且發(fā)展趨勢(shì)向著疑難雜癥轉(zhuǎn)變[1-2]，其中以牛的呼吸道、胃腸道疾病為典型，往往也是最易造成牛的死亡，其極高的發(fā)病率，也為牛場(chǎng)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)黑龍江省杜蒙烏力吉圖某奶牛場(chǎng)的流行病學(xué)調(diào)查和送檢的2份病料進(jìn)行PCR病原鑒定和細(xì)菌分離鑒定，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)?，F(xiàn)將診斷過程及結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 烏力吉圖奶牛場(chǎng)送檢的2份從心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)、各處黏膜采集的樣本存放于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣本的處理 取每個(gè)組織樣本1 g混合于玻璃研磨器中，加入DEPC水2 mL，研磨至樣本均勻。倒出研磨液，稀釋至肉粉色(或無明顯血液)達(dá)到合理濃度。

用同樣方法取每個(gè)組織樣本1 g于玻璃研磨器中用生理鹽水稀釋一遍做細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)。

1.2.2細(xì)菌分離培養(yǎng) 將處理后的兩份樣本在血瓊脂平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)(37 ℃,24 h)，觀察細(xì)菌菌落生長(zhǎng)情況，隨后涂板進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。

1.2.3藥敏實(shí)驗(yàn) 挑取細(xì)菌菌落用生理鹽水制成菌液均勻涂于血平板上，用上述藥片進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。

1.2.4菌樣樣本DNA/RNA的提取 提取菌樣樣本DNA采用天根(TIANGEN)TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)。

提取菌樣樣本RNA采用天根(TIANGEN)RNAsimple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒(離心柱型)。

依據(jù)DNA/RNA提取試劑盒使用說明書按步驟進(jìn)行操作提取所需菌樣樣本DNA及RNA。

1.2.5十三對(duì)PCR引物及其反應(yīng)條件 各病原各自對(duì)應(yīng)的引物序列及退火溫度如表1所示。其所需的反應(yīng)條件及其所需的反應(yīng)參數(shù)如表2所示。

表1 十三對(duì)PCR引物及其反應(yīng)條件

表2 PCR反應(yīng)程序

2 結(jié)果

2.1藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：1號(hào)病料樣本對(duì)鹽酸林可霉素敏感，對(duì)鏈霉素、恩諾沙星中度敏感，對(duì)硫酸慶大霉素有耐藥性；2號(hào)病料樣本對(duì)鏈霉素敏感，對(duì)鹽酸林可霉素、恩諾沙星中度敏感對(duì)氟苯尼考有耐藥性，詳細(xì)結(jié)果如表3所示。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2SS鑒別培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如圖1所示，經(jīng)SS瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定，培養(yǎng)鑒定出粉紅色大腸桿菌菌落，無黑色沙門氏菌菌落。

2.3PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用紫外凝膠成像分析儀攝像核酸電泳凝膠成像，其結(jié)果如圖2所示。1號(hào)病料樣本檢測(cè)出的致病病原為：魏氏梭菌α、牛克雷伯氏菌、牛溶血性曼氏桿菌病、多殺性巴氏桿菌、?；撾[秘桿菌、牛冠狀病毒和牛輪狀病毒。2號(hào)病料樣本檢測(cè)出的致病病原為、魏氏梭菌α、牛傳染性鼻氣管炎、?？死撞暇?、牛溶血性曼氏桿菌病、多殺性巴氏桿菌和?；撾[秘桿菌，詳細(xì)結(jié)果如表4所示。

圖1 SS瓊脂培養(yǎng)基鑒定

注：M代表marker，M左側(cè)1-13為1號(hào)混合病料檢測(cè)；右側(cè)1-13為2號(hào)混合病料檢測(cè)。圖2 兩份病料PCR結(jié)果圖

表4 PCR結(jié)果表

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)兩例混合病料檢出：1號(hào)病料其主要致病病原為大腸桿菌、魏氏梭菌α、牛克雷伯氏菌、牛溶血性曼氏桿菌病、多殺性巴氏桿菌、牛化膿隱秘桿菌、牛冠狀病毒和牛輪狀病毒。2號(hào)病料其主要致病病原為大腸桿菌、魏氏梭菌α、牛傳染性鼻氣管炎、牛克雷伯氏菌、牛溶血性曼氏桿菌病、多殺性巴氏桿菌和?；撾[秘桿菌。

藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1號(hào)樣本對(duì)鹽酸林可霉素敏感，對(duì)鏈霉素、恩諾沙星中度敏感，對(duì)硫酸慶大霉素有耐藥性；2號(hào)樣本對(duì)鏈霉素敏感，對(duì)鹽酸林可霉素、恩諾沙星中度敏感對(duì)氟苯尼考有耐藥性。分離出的細(xì)菌主要是條件致病菌和環(huán)境致病菌，因此要保持牛場(chǎng)環(huán)境的污染小，并減少外界環(huán)境對(duì)牛的刺激，以免應(yīng)激后增加發(fā)病率。當(dāng)本牛場(chǎng)出現(xiàn)以呼吸道和消化道疾病為主要特征的病例時(shí)，可首選鏈霉素和鹽酸林可霉素作為治療藥物，并采取隔離措施，對(duì)類似情況有一定指導(dǎo)意義。由于耐藥性的存在，在治療中應(yīng)使用多種敏感藥物聯(lián)合或交替使用，以減少單一藥物的劑量或使用時(shí)間以達(dá)到更好的治療效果[4-6]。

近幾年國(guó)內(nèi)外牛呼吸系統(tǒng)疾病頻發(fā)，有國(guó)外的學(xué)者將由支原體和多種細(xì)菌或病毒引起的牛肺炎、支氣管炎、運(yùn)輸熱等統(tǒng)稱為牛呼吸道疾病綜合征，該類病癥會(huì)對(duì)牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此我國(guó)采取了重大動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫措施，以從源頭上預(yù)防并控制疾病，且已經(jīng)取得了不錯(cuò)的效果。由此可見現(xiàn)階段對(duì)細(xì)菌性病原的致病機(jī)理和防控技術(shù)研究具有重大意義[7-9]。

本病例雖未檢出牛腹瀉黏膜病毒，但牛病毒性腹瀉病在牛群養(yǎng)殖的過程中常見，且極易流行，各個(gè)年齡段的牛都容易受此病毒的感染，特別是犢牛，一旦發(fā)作便會(huì)導(dǎo)致急性牛病，臨床特征常以發(fā)熱且嚴(yán)重腹瀉，并且其排泄物當(dāng)中都含有此類病毒，因此牛舍的環(huán)境對(duì)該病的傳染有十分巨大的影響，要做到及時(shí)清潔保持牛舍的比較干凈、干燥舒適的環(huán)境[10-12]。