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        應(yīng)用PCR擴增方法對一起豬呼吸道混合感染的診斷

        2020-12-29 08:37:00章國永王曉杜
        浙江畜牧獸醫(yī) 2020年6期
        關(guān)鍵詞:豬鼻病死豬圓環(huán)

        章國永,王曉杜

        (蒼南縣動物疫病預(yù)防控制中心,浙江 溫州 325800;2.浙江農(nóng)林大學)

        豬呼吸道疾病,臨床以咳嗽、氣喘、張口呼吸、生長緩慢為特征,病理剖檢以肺部發(fā)生肉樣或肝樣病變,肺門淋巴結(jié)腫大為主,在全世界廣泛流行。單純感染豬肺炎支原體的豬只死亡率較低,但發(fā)病率高,且常常誘發(fā)其他病原微生物感染,引起臨床癥狀加重、病死率增加,給養(yǎng)殖戶造成嚴重的經(jīng)濟損失[1]??梢酝ㄟ^體外培養(yǎng)、多克隆抗體免疫熒光法[2-3]、PCR[4]等方法對豬肺炎支原體進行診斷。但是體外培養(yǎng)條件苛刻,現(xiàn)在常常用PCR的方法進行快速診斷。

        1 發(fā)病情況

        杭州某地方品種豬場,存欄300多頭,該場管理不規(guī)范,沒有進行正規(guī)的群體性免疫。在2014年7-8月份,筆者在該豬場實習,期間發(fā)現(xiàn)該場豬群出現(xiàn)與豬喘氣病相似的臨床癥狀。豬群呈群體性間歇性咳嗽,3-4月齡的育肥豬呈現(xiàn)張口喘氣(時間持續(xù)在30 s左右),間歇性的咳嗽,劇烈運動后更加明顯,腹式呼吸,甚至犬坐式呼吸等呼吸道疾病癥狀。病豬精神萎靡、食欲不振、生長緩慢,漸行性消瘦。有些病豬體溫升高至41~42℃,到病程后期,體溫低下,呼吸極度困難,伴有泡沫狀的口鼻分泌液,死亡后4~5 h有帶血樣的鼻液流出(見圖1所示)。5月齡及以上的育肥豬,表現(xiàn)為運動氣喘、拱背伸頸、咳嗽、毛發(fā)粗糙,未見豬只死亡。

        圖1 病豬臨床癥狀

        2 病理剖檢結(jié)果

        病理變化尸體剖檢眼觀病變主要在肺部。剖檢病豬10頭,可以發(fā)現(xiàn)9頭肺葉有病變跡象,肺腫大、出血,呈暗紅色、灰白色、淺紅色,界限明顯(如圖2-1、圖2-3所示)。硬度增加,外觀呈“鮮肉樣”、“蝦肉樣”病變(如圖2-2、圖2-4所示)。7頭頜下淋巴結(jié)、腸系膜、腹股溝等處淋巴結(jié)腫大出血或壞死。其中有1頭病死豬病程一周多,每天用抗生素治療,死后發(fā)現(xiàn)該豬腸系膜粘連,胰臟、脾臟等器官萎縮壞死,皮膚出現(xiàn)紫色斑點。采集病死豬,病變明顯的器官,肺臟、淋巴、小腸、脾臟等,用于后續(xù)實驗室診斷。

        圖2 病死豬剖檢結(jié)果

        3 實驗室診斷方法與結(jié)果

        根據(jù)參考文獻報導(dǎo)[5],豬肺炎支原體(ATCC 25934)外顯性p36(948 bp) 蛋白基因,構(gòu)建檢測豬肺炎支原體(948 bp)引物FSp36-RSp36,根據(jù)豬鼻支原體p37外顯性蛋白基因,構(gòu)建一對引物:Sp37-Asp37,用于檢測豬鼻支原體(346 bp)。豬圓環(huán)病毒由浙江農(nóng)林大學申老師實驗室根據(jù)PCV2的ORF2基因設(shè)計的引物P20RF2F-P20RF2R,對病料進行PCR擴增鑒定后,送至上海生物工程有限公司合成,引物名稱、核苷酸序列、目的基因大小如表1所示。

        表1 PCR引物名稱及其序列

        3.1圓環(huán)病毒鑒別診斷 圓環(huán)病毒感染可引起豬群免疫損傷,是引起豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)的病原體之一。而該養(yǎng)殖場豬群以呼吸道疾病為主,病死豬很可能因為豬群免疫損傷繼發(fā)支原體感染,導(dǎo)致死亡率增加,故有必要對豬群進行PCV2的鑒別診斷。

        用引物(P2ORF2F-P2ORF2R)檢測豬圓環(huán)病毒(667 bp)。結(jié)果如圖3所示。2-10號樣電泳結(jié)果呈陽性,陽性率80%(95% CI=44.4%, 97.5%),表明這8頭豬均受到圓環(huán)病毒感染。

        圖3 圓環(huán)病毒-ORF2基因PCR擴增產(chǎn)物鑒定

        3.2豬鼻支原體檢測結(jié)果 豬鼻支原體,也可粘附到豬的呼吸道上皮細胞上,引起豬的肺炎,還可能引起漿膜炎、中耳炎等臨床癥狀[6],為了與豬肺炎支原體做出鑒別診斷,本研究用引物(Sp37-Asp37)檢測10頭病死豬肺部組織樣本,結(jié)果如圖4所示,僅9號樣電泳結(jié)果呈陽性,陽性率10%(95% CI=0.3%, 44.5%),表明10頭豬中僅一頭豬受到鼻支原體感染,說明該養(yǎng)殖場主要的病原不是豬鼻支原體。

        圖4 豬鼻炎支原體-p37基因PCR擴增產(chǎn)物鑒定

        3.3豬肺炎支原體檢測結(jié)果 用該對引物(FSp36-RSp36)檢測10頭病死豬肺部組織樣本,結(jié)果如圖5所示。3、4、6、7、8、9號樣電泳結(jié)果呈陽性,其中3、6號樣本呈弱陽性,陽性率60%(95% CI=26.2%, 87.8%)。表明這6頭豬均受到豬肺炎支原體感染,初步說明該病的病原體為豬肺炎支原體。

        圖5 豬肺炎支原體-P36基因PCR擴增產(chǎn)物鑒定

        4 討論與結(jié)論

        豬氣喘病是地方性豬場的慢性呼吸道疾病,不同品種、性別、年齡的豬均可感染豬肺炎支原體,引起豬的氣喘病。本研究對10頭病死豬進行病理剖檢,發(fā)現(xiàn)肺出血,呈暗紅色、淺紅色,“鮮肉樣”、“蝦肉樣”病變。采集處理病死豬的肺臟,用PCR方法進行實驗室診斷,結(jié)果顯示:圓環(huán)病毒陽性率80%(CI 95%=44.4%-97.5%),豬鼻支原體陽性率10%(CI 95%=0.3%-44.5%),豬肺炎支原體陽性率60%(CI 95%=26.2%-87.8%)。說明該豬場很可能嚴重受到PCV2污染,引起豬免疫損傷,造成免疫力低下,繼發(fā)支原體感染,增加死亡率。豬鼻支原體的陽性率遠低于豬肺炎支原體,說明該豬場的氣喘病很可能是由于豬肺炎支原體引起。

        結(jié)合臨床癥狀、病理剖檢和PCR診斷三者的結(jié)果,表明該豬場確實受到圓環(huán)病毒和肺炎支原體混合感染。該養(yǎng)殖場豬圓環(huán)病毒疫苗和豬肺炎支原體疫苗是不納在常規(guī)疫苗之內(nèi)的,建議豬場將這兩種疫苗列入免疫計劃之內(nèi),并加強飼養(yǎng)管理,建立科學養(yǎng)殖觀念。

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