肖韻錚， 韓世明， 秦昭， 李春奇

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.六盤水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州 六盤水 553000)

黃精(Polygonati rhizoma)是著名的藥食兩用植物,包括黃精(PolygonatumsiricumRed.)、滇黃精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.)等品種。滇黃精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl)為百合科黃精屬多年生草本植物，主要分布于中國(guó)西南地區(qū),主產(chǎn)于云南省,以根莖入藥，是中國(guó)常用的中草藥[1]。滇黃精富含黃酮類化合物(flavonoids)。黃酮類化合物又稱類黃酮，是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物，具有抗衰老、降血糖、改善血液循環(huán)等保健功能，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值[2-3]。目前，滇黃精和其次生代謝產(chǎn)物合成機(jī)理鮮有報(bào)道，尤其對(duì)滇黃精類黃酮合成的分子機(jī)理研究較少。因此，本試驗(yàn)以滇黃精為研究對(duì)象進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析，并對(duì)影響滇黃精類黃酮含量的關(guān)鍵基因進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為解析類黃酮生物合成分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)是利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)生物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，目前已廣泛應(yīng)用于生物基因組基因表達(dá)的研究[4-7]，包括人參[8]、柴胡[9]以及甘草[10]等藥用植物已通過(guò)該技術(shù)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。RNA-Seq技術(shù)不僅可以用于檢測(cè)和分析有基因組序列的生物體中的轉(zhuǎn)錄本，還可以用于組裝短片段，在無(wú)參考基因組的生物體中進(jìn)行基因發(fā)現(xiàn)和基因表達(dá)分析[11]。鑒于此，本研究以滇黃精根、莖和葉為對(duì)象進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)數(shù)據(jù)分析挖掘與類黃酮生物合成途徑相關(guān)的功能基因，為滇黃精功能基因鑒定和遺傳改良奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

滇黃精植株由六盤水師范學(xué)院提供。選擇9株生長(zhǎng)狀態(tài)良好且長(zhǎng)勢(shì)相同的6個(gè)月盆栽苗。每3株為1組，共3組。第1組取根、莖和葉分別放入 3 個(gè)離心管中，其余組取材時(shí)選取發(fā)育階段相似、部位相同的根、莖和葉，共計(jì)9個(gè)樣本，3次生物學(xué)重復(fù)。取樣后立即置于液氮速凍保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取、文庫(kù)的制備和測(cè)序

從滇黃精器官樣品(根、莖和葉)中提取總RNA，RNA提取使用植物總RNA提取試劑盒(Quick RNA isolation Kit，北京華越洋生物科技有限公司)。使用微量紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific, NANO, DROP2000)對(duì)總RNA進(jìn)行定量，并通過(guò)測(cè)量A260/A280和A260/A230檢測(cè)總RNA的純度，將純化的RNA溶解在RNasefree水中并儲(chǔ)存在-80 ℃。測(cè)得樣品質(zhì)量濃度不小于400 mg·L-1，OD260/OD280=1.8～2.2，28S∶18S≥1.5∶1.0。將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并通過(guò)PCR擴(kuò)增富集得到最終的cDNA文庫(kù)，完成文庫(kù)制備。庫(kù)檢合格后，使用Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)(北京百邁客生物科技有限公司)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 質(zhì)量控制、序列組裝和功能注釋

采用Illumina HiSeq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，去除reads中的測(cè)序接頭、引物序列以及低質(zhì)量reads(質(zhì)量值Q<30)，對(duì)于得到的高質(zhì)量reads(clean reads)用Trinity軟件進(jìn)行組裝。從獲得的基因功能信息中，將組裝得到的滇黃精的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)與公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，并使用HMMER軟件與Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)獲得注釋信息。公共數(shù)據(jù)庫(kù)為非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Nr)(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/)、蛋白質(zhì)家族(Pfam)(http://pfam.xfam.org/)、直系同源蛋白質(zhì)簇(KOG/COG/eggNOG)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/KOG/; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/; http://eggnogdb.embl.de/)、Swiss-Prot 蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Swiss-Prot)(http://www.uniprot.org/)、基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)(GO)(http://www.geneontology.org/)和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)(http://www.genome.jp/kegg/)。BLAST參數(shù)E-value≤10-5,HMMER軟件參數(shù)E-value≤10-10，通過(guò)序列相似性進(jìn)行功能注釋。

1.4 差異表達(dá)基因的篩選

采用Bowtie軟件[12]將測(cè)序獲得的 reads與unigenes庫(kù)比對(duì)，并使用 RSEM軟件[13]根據(jù)比對(duì)結(jié)果對(duì)表達(dá)量水平進(jìn)行估計(jì)。使用每百萬(wàn)reads中比對(duì)到某一基因每千堿基長(zhǎng)度的reads數(shù)目(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads, FPKM)表示對(duì)應(yīng)unigenes的表達(dá)豐度。然后用DESeq方法[14]對(duì)樣品進(jìn)行差異表達(dá)分析，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.05且倍數(shù)差異(fold change，F(xiàn)C)>2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。GO功能富集采用topGO軟件(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/topGO.html)進(jìn)行分析，使用KOBAS2.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/help.do)對(duì)差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)進(jìn)行KEGG富集分析。

1.5 類黃酮含量的測(cè)定

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(生工生物工程上海股份有限公司，分析純)來(lái)配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%乙醇為溶劑)，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%乙醇作為對(duì)照，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定510 nm 處的吸光值。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測(cè)定滇黃精不同器官中類黃酮的含量，參照劉清華等[15]的方法稍作修改。稱取滇黃精根、莖和葉樣品各0.2 g，按照料液比m(樣品)∶V(質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%乙醇)=1∶15分別置于10 mL試管中，超聲提取50 min，后10 000 r·min-1離心10 min，取1 mL上清液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液稀釋到5 mL，吸取2 mL定容至10 mL，測(cè)定其在510 nm處吸光值，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%乙醇作為對(duì)照，查詢標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中類黃酮質(zhì)量濃度，再按下式計(jì)算不同器官中類黃酮含量：

M=(c×v×d)/m

(1)

式中：M表示類黃酮含量；c表示提取液中類黃酮質(zhì)量濃度；v表示待測(cè)提取液總體積；d表示總稀釋倍數(shù)；m表示滇黃精樣品質(zhì)量。

1.6 差異表達(dá)基因的qRT-PCR

總RNA提取使用植物總RNA提取試劑盒(Quick RNA isolation Kit，北京華越洋生物科技有限公司)。使用FSQ-101反轉(zhuǎn)錄試劑盒(東洋紡(上海)生物科技有限公司)將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。依據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，篩選得到10個(gè)與類黃酮合成相關(guān)的差異基因，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LC480，瑞士羅氏集團(tuán))以及SYBR qPCR Mix試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。qPCR的引物由NCBI/Primer-BLAST界面進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，如表1所示。引物序列長(zhǎng)度范圍18～25 bp，基因擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度限制100～350 bp。以18S rRNA為內(nèi)參基因，上游引物為CTTGCGACCTGGAGTTATTGAT，下游引物為CTGCAACACTGCTCTTGCTC[16]。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照崔雯等[17]方法。

表1 熒光定量PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 滇黃精轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝分析結(jié)果

采用Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)技術(shù)得到滇黃精轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。對(duì)獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，完成滇黃精樣品的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，去除raw data中的接頭序列及低質(zhì)量reads獲得高質(zhì)量的clean data 40.92 Gb，各樣品clean data均達(dá)到5.93 Gb，Q30堿基比例在91.94%以上，通過(guò)組裝后共產(chǎn)生了390 456條轉(zhuǎn)錄本，平均長(zhǎng)度為770.38 bp，轉(zhuǎn)錄本N50長(zhǎng)度為1 350 bp。對(duì)轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)一步組裝拼接，共獲得了219 769條unigenes序列，平均長(zhǎng)度為502.31 bp，N50長(zhǎng)度為627 bp。其中，轉(zhuǎn)錄本在200～300 bp之間有139 323條，300～500 bp 之間有83 204條，大于2 000 bp的有32 976條，如圖1所示。

2.2 滇黃精unigenes序列功能注釋

將獲得的unigenes進(jìn)行基因功能注釋以得到全面的基因功能信息，數(shù)據(jù)庫(kù)分別為Nr、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、eggNOG、KEGG以及GO。經(jīng)過(guò)BLAST程序?qū)Ρ?，?19 769條滇黃精unigenes中，共有81 853條unigenes被注釋到，覆蓋率為37.2%。如表2所示，以數(shù)據(jù)庫(kù)Nr注釋成功率最高(34.7%)，其次為eggNOG(30.5%)、Pfam(20.7%)、KOG(19.7%)、GO(18.0%)、Swiss-Prot(16.1%)、KEGG(11.9%)和COG(11.2%)。

圖1 滇黃精轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)和unigenes的長(zhǎng)度分布情況

2.3 滇黃精unigenes的GO和KOG功能分類

2.3.1 滇黃精unigenes的GO分類 根據(jù)unigenes的GO功能分析，滇黃精unigenes的GO注釋結(jié)果如圖2所示。在219 769條unigenes中，共有39 479條unigenes(18.0%)被注釋到GO條目中，并被分為3個(gè)主要類別，即生物過(guò)程(99 866條)、分子功能(48 515條)和細(xì)胞組分(78 215條)。在20個(gè)生物過(guò)程中，unigenes最多的為參與代謝過(guò)程(28 018條)和細(xì)胞過(guò)程(23 119條)，其次是單一有機(jī)體過(guò)程(17 934條)；在18個(gè)細(xì)胞組分中，unigenes最多的是細(xì)胞(18 352條)和細(xì)胞組分(18 352條)，其次是細(xì)胞器(14 245條)和細(xì)胞膜(8 512條)；在16個(gè)分子功能中，unigenes最多的是催化活性(21 212條)和綁定功能(19 999條)。

表2 Unigenes注釋的成功率統(tǒng)計(jì)

注： 1.胞外區(qū)； 2.膠原三聚體；3.細(xì)胞； 4.擬核； 5.細(xì)胞膜； 6.病毒粒子；7.細(xì)胞連接；8.胞外基質(zhì)； 9.膜內(nèi)腔；10.大分子復(fù)合物； 11.細(xì)胞器 12.細(xì)胞外基質(zhì)部分；13.胞外區(qū)組件；14.細(xì)胞器組件；15.病毒粒子部分；16.細(xì)胞膜組件；17.細(xì)胞組件；18.共質(zhì)體；19.蛋白質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性；20.核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性；21.催化活性； 22.受體活性； 23.鳥(niǎo)苷酸交換因子活性；24.結(jié)構(gòu)分子活性；25.轉(zhuǎn)運(yùn)器活性；26.綁定； 27.電子載體活性； 28.抗氧化活性； 29.金屬伴侶活性 30.酶調(diào)節(jié)劑活性； 31.蛋白標(biāo)簽 32.翻譯調(diào)節(jié)器活性；33.營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)層活動(dòng)； 34.分子傳感器活性；35.生殖；36.細(xì)胞殺傷；37.免疫系統(tǒng)進(jìn)程 ；38.代謝進(jìn)程；39.細(xì)胞進(jìn)程； 40.生殖進(jìn)程；41.生物黏附 ； 42.信號(hào)；43.多細(xì)胞有機(jī)體進(jìn)程；44.發(fā)育進(jìn)程 ；45.生長(zhǎng)； 46.運(yùn)動(dòng)力； 47.單一有機(jī)體進(jìn)程；48.生物相；49.節(jié)律進(jìn)程；50.應(yīng)激反應(yīng)； 51.定位；52.多有機(jī)體進(jìn)程；53.生物調(diào)節(jié)； 54.細(xì)胞成分組織或生物合成。

2.3.2 滇黃精unigenes的KOG分類 將組裝得到的unigenes在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，共有43 295條unigenes具有明顯的序列相似性且被注釋到25個(gè)分類中，如圖3所示。在滇黃精器官中，一般功能預(yù)測(cè)類的unigenes最多為10 244條，其次是翻譯后修飾為4 904條；而細(xì)胞運(yùn)動(dòng)是最少的類別為44條。

注: A: RNA加工和修飾; B: 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)力; C: 能量的產(chǎn)生及轉(zhuǎn)換; D: 細(xì)胞周期控制, 細(xì)胞分裂, 染色體分區(qū); E: 氨基酸運(yùn)輸與代謝; F: 核苷酸運(yùn)輸與代謝; G: 碳水化合物的運(yùn)輸與代謝; H: 輔酶運(yùn)輸與代謝; I: 脂質(zhì)運(yùn)輸與代謝; J: 翻譯, 核糖體結(jié)構(gòu)和生物轉(zhuǎn)化; K: 轉(zhuǎn)錄; L: 復(fù)制, 重組和修復(fù); M: 細(xì)胞壁, 細(xì)胞膜的發(fā)生; N: 細(xì)胞移動(dòng); O:蛋白翻譯后修飾, 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換,分子伴侶; P: 無(wú)機(jī)離子運(yùn)輸與代謝; Q: 次生代謝產(chǎn)物生物合成, 運(yùn)輸和分解代謝; R: 一般功能基因; S:功能未知; T: 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制; U: 細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸, 分泌和膜泡運(yùn)輸; V: 防御機(jī)制; W: 細(xì)胞外結(jié)構(gòu); Y: 細(xì)胞核結(jié)構(gòu); Z: 細(xì)胞骨架。

2.4 滇黃精差異基因的表達(dá)分析

滇黃精3個(gè)器官中共同表達(dá)的 unigenes有20 573條，根和莖、根和葉以及莖和葉中分別有930、 256、 1 171條unigenes特異表達(dá)，如圖4所示。以莖為對(duì)照，根中有2 361條DEGs，包括921條上調(diào)和1 440條下調(diào)；以葉為對(duì)照，根中有2 862條DEGs，包括1 340條上調(diào)和1 522條下調(diào)；以葉為對(duì)照，莖中有100條DEGs，包括27條上調(diào)和73條下調(diào)，如圖5所示。

圖4 滇黃精Unigenes的維恩圖

圖5 滇黃精差異表達(dá)基因數(shù)目

2.5 滇黃精差異基因功能注釋和富集分析

在7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中，本研究對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，并且繪制了不同器官之間(根和莖、根和葉、莖和葉)差異表達(dá)基因的GO功能分類圖，如表3和圖6所示，圖中橫坐標(biāo)表示GO的3個(gè)模塊(生物學(xué)過(guò)程、 細(xì)胞組分、分子功能)，縱坐標(biāo)左側(cè)表示差異表達(dá)基因數(shù)量，右側(cè)表示所有基因數(shù)量。利用KEGG代謝途徑數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因KEGG的注釋結(jié)果進(jìn)行分類，如圖7所示，圖中橫坐標(biāo)表示的是注釋到該通路下的基因數(shù)量及其與被注釋上的基因總數(shù)的比例，縱坐標(biāo)表示的是KEGG代謝通路的名稱。根據(jù)注釋結(jié)果，共有26 259條(11.9%)unigenes注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，和通路相關(guān)的為16 574條。在根和莖中，和通路相關(guān)的差異表達(dá)基因總數(shù)為483條，分別注釋到105條代謝通路；在根和葉中，和通路相關(guān)的差異表達(dá)基因總數(shù)為560條，分別注釋到108條代謝通路；在莖和葉中，和通路相關(guān)的差異表達(dá)基因總數(shù)為18條，分別注釋到22條通路中。富集通路主要集中在核糖體(ko03010)，另外是光合作用(ko00195)、碳代謝(ko01200)、苯丙烷類生物合成(ko00940)、淀粉和蔗糖代謝(ko00500)，這表明與類黃酮合成相關(guān)通路是差異基因主要富集通路之一。滇黃精unigenes代謝途徑可分成5大類，涉及unigenes數(shù)量最多的前3個(gè)代謝途徑分別為核糖體、碳代謝和光合作用。不同組間代謝通路比例最高，而有機(jī)系統(tǒng)通路比例最低。與核糖體相關(guān)的unigenes為2 254條，其次是碳代謝相關(guān)的unigenes為1 418條。對(duì)KEGG中的pathway通路進(jìn)行分析，結(jié)合unigenes的注釋情況，發(fā)現(xiàn)滇黃精根中高表達(dá)基因的功能主要與自身能量?jī)?chǔ)藏代謝相關(guān)，莖和葉高表達(dá)基因功能主要與葉綠素代謝相關(guān)。

表3 滇黃精器官間注釋的差異表達(dá)基因數(shù)(DEGs)

注：1.代謝過(guò)程； 2.細(xì)胞過(guò)程； 3.單一有機(jī)體進(jìn)程； 4.定位；5.應(yīng)激反應(yīng)； 6.生物調(diào)節(jié)；7.細(xì)胞成分組織或生物合成； 8.發(fā)育過(guò)程； 9.多細(xì)胞生物過(guò)程； 10.信號(hào)；11.生殖過(guò)程； 12.多組織過(guò)程； 13.生殖； 14.生長(zhǎng)； 15.免疫系統(tǒng)過(guò)程； 16.生物附著；17.生物相； 18.節(jié)律性過(guò)程；19.運(yùn)動(dòng)；20.細(xì)胞殺傷性；21.細(xì)胞；22.細(xì)胞組件； 23.細(xì)胞器；24.細(xì)胞膜；25.大分子復(fù)合物；26.細(xì)胞器組件；27.細(xì)胞膜組件；28.膜內(nèi)腔； 29.胞外區(qū)； 30.細(xì)胞連接；31.共質(zhì)體；32.擬核； 33.胞外區(qū)組件； 34.細(xì)胞外基質(zhì)；35.細(xì)胞外基質(zhì)部分36.病毒粒子； 37.病毒粒子組件；38.膠原三聚體; 39.催化活性；40.結(jié)合；41.轉(zhuǎn)運(yùn)活性； 42.結(jié)構(gòu)分子活性； 43.電子載體活性；44.核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性；45.抗氧化活性；46.酶調(diào)節(jié)劑活性47.分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性；48.受體活性； 49.鳥(niǎo)苷酸交換因子活性 50.轉(zhuǎn)錄因子活性，蛋白結(jié)合；51.營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性；52.金屬伴侶活性；53.蛋白標(biāo)簽； 54.翻譯調(diào)控活性。橫坐標(biāo)表示GO的3個(gè)模塊(生物學(xué)過(guò)程、 細(xì)胞組分、分子功能)。

圖7 滇黃精器官間差異表達(dá)基因的KEGG代謝途徑分析圖

2.6 滇黃精類黃酮合成基因的篩選

2.6.1 滇黃精類黃酮含量測(cè)定結(jié)果 滇黃精根、莖和葉中類黃酮含量測(cè)定結(jié)果如表4所示。滇黃精中不同器官的類黃酮的含量差異較大，從大到小排列的順序依次是：葉>莖>根，表現(xiàn)出明顯的器官特異性。結(jié)合根、莖和葉中差異基因的富集情況，發(fā)現(xiàn)莖與葉的差異基因數(shù)量較少且富集通路分布規(guī)律相同，而根與葉和莖的差異基因數(shù)量較多，差別較大，推測(cè)可能與類黃酮代謝通路中關(guān)鍵酶的合成有關(guān)。

表4 滇黃精根、莖、葉中類黃酮的含量

2.6.2 滇黃精類黃酮途徑上差異基因的表達(dá) 經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)挖掘，篩選出與類黃酮生物合成相關(guān)的10個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)這些差異基因在器官中均有表達(dá)，但規(guī)律不盡一致，如圖8所示。CHI和CHS在葉中呈現(xiàn)高水平表達(dá)，而在根和莖中的表達(dá)量較低。DFR、F3’H、C3’H、LAR、CYP73A、CCOMT在根中呈現(xiàn)高水平表達(dá)，莖和葉中的表達(dá)量較低。ANR在莖中呈現(xiàn)高水平表達(dá)，但根和葉中表達(dá)量較低。FLS在根、莖和葉中均有表達(dá)，器官之間無(wú)顯著性差異。對(duì)滇黃精根、莖和葉中類黃酮的含量與類黃酮途徑中10個(gè)結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行相關(guān)性分析，如表5所示。CHI和CHS與滇黃精器官中類黃酮含量呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明CHI和CHS是類黃酮生物合成途徑中的關(guān)鍵基因，其基因的表達(dá)量決定了類黃酮的合成量。

3 結(jié)論與討論

滇黃精是中國(guó)著名的藥食兩用植物，具有健脾補(bǔ)氣、降血糖和抗衰老等功效，黃酮類化合物是其主要的活性成分[18]。目前，關(guān)于滇黃精的研究主要集中在多糖和甾體皂苷類等途徑[19-22]，對(duì)類黃酮代謝途徑的研究卻鮮有報(bào)道。為了挖掘參與類黃酮生物合成的功能基因，本試驗(yàn)通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)滇黃精根、莖和葉進(jìn)行 RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并進(jìn)行組裝，最終獲得219 769 條unigenes，平均長(zhǎng)度為502.31 bp，N50為627 bp，Q30值分別為92.70%、 93.27%和92.54%，均大于90%；獲得390 456條轉(zhuǎn)錄本，其中在200～1 000 bp范圍內(nèi)的有91.55%，32 976條轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)2.0 kb。這些結(jié)果表明滇黃精轉(zhuǎn)錄組序列組裝質(zhì)量較高。將組裝后的序列在多個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注釋，共有81 853條unigenes至少在1個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得功能注釋，但仍有137 916條unigenes未被注釋，推測(cè)與序列片段較短及滇黃精缺少保守的核心序列和基因組信息有關(guān)。

本研究通過(guò)pathway分析，發(fā)現(xiàn)有26 259條(11.9%)unigenes注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，和通路相關(guān)的所有基因總數(shù)為16 574條。在根和莖中，和通路相關(guān)的差異表達(dá)基因總數(shù)為483條，在根和葉中，和通路相關(guān)的差異表達(dá)基因總數(shù)為560條，在莖和葉中，和通路相關(guān)的差異表達(dá)基因總數(shù)為18條。結(jié)合篩選到的 unigenes 在相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中予以的功能注釋，進(jìn)一步確保了所獲得基因的可靠性。通過(guò)不同器官比較，發(fā)現(xiàn)根中的差異基因數(shù)量較多，而大多數(shù)基因在莖和葉中的表達(dá)模式比根中的表達(dá)模式更穩(wěn)定。對(duì)差異基因的注釋和富集情況進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，滇黃精根中高表達(dá)基因的功能主要與自身能量?jī)?chǔ)藏代謝相關(guān)，莖和葉高表達(dá)基因功能主要與葉綠素代謝相關(guān)，這一研究結(jié)果與器官功能特性相符，說(shuō)明根的主要功能與物質(zhì)的吸收和能量?jī)?chǔ)藏有關(guān)，莖和葉的主要功能與物質(zhì)運(yùn)輸、光合作用和呼吸作用等有關(guān)。同時(shí)，鑒定到與類黃酮生物合成相關(guān)的unigenes有46條，以及大量與萜類物質(zhì)合成相關(guān)的unigenes，這也為解析滇黃精黃酮類和萜類物質(zhì)的合成途徑提供了數(shù)據(jù)支撐。

注：A～J為CHS、CHI、DFR、F3’H、C3’H、CCOMT、LAR、CYP73A、ANR和FLS的表達(dá)分析。不同小寫字母表示差異性顯著，顯著性水平P<0.05。

表5 滇黃精不同器官中類黃酮含量與類黃酮途徑差異表達(dá)基因相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步解析滇黃精類黃酮合成的分子機(jī)制，本研究對(duì)滇黃精不同器官中的類黃酮的總含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明不同器官中類黃酮含量存在顯著差異，其中葉中類黃酮含量最高，莖次之，根最少，這與北京檸檬[23]、溪黃草[24]、棉花[25]等物種研究結(jié)果相一致，表現(xiàn)出明顯的器官特異性?；谵D(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，本試驗(yàn)共篩選出10個(gè)與滇黃精類黃酮生物合成相關(guān)的差異基因，通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)了其在滇黃精不同器官中的表達(dá)水平，并與類黃酮含量進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)CHS和CHI基因表達(dá)水平與不同器官中類黃酮含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。在柑橘[23]、銀杏[26]等物種中，CHS基因的表達(dá)與類黃酮含量變化趨勢(shì)基本一致。在藥用植物鹽膚木[27]中，CHI基因的表達(dá)與不同器官類黃酮含量也呈良好的正相關(guān)關(guān)系。這些研究與本研究結(jié)果相符，表明CHI和CHS是滇黃精類黃酮生物合成的關(guān)鍵基因，且基因表達(dá)水平是導(dǎo)致類黃酮含量差異的重要因素。本研究為滇黃精提供了根、莖和葉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)對(duì)滇黃精類黃酮代謝通路的分析，為挖掘類黃酮生物合成相關(guān)基因提供了重要理論依據(jù)，也為探究該植物次生代謝途徑和更多分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)，有利于將滇黃精作為藥用植物資源的開(kāi)發(fā)和利用。